研究室での研究「生細胞における酵素の触媒活性」。研究室での研究「ペルオキシダーゼの触媒活性」

研究室での作業

カタラーゼ活性の測定 (1.11.1.6)

1) 過マンガン酸カリウムを使用してカタラーゼ価を計算する（バッハ＆ズブコワ方式）

方法の原理。カタラーゼという酵素は、大量の赤血球だけでなく、体のすべての組織や体液にも含まれています。カタラーゼの生物学的役割は、過酸化水素 (H 2O2 ) 酸素分子と水への分解により:

2H 2 O 2 → O 2 + 2H 2 O

酵素活性は、カタラーゼ番号とカタラーゼインデックスを使用して表されます。カタラーゼ数一定時間内に血液1.0μlによって分解される過酸化水素のmg数です。分割過酸化水素の量は、対照サンプルと実験サンプルの滴定に使用した過マンガン酸カリウムの量の差によって判断されます。

カタラーゼ指示薬は、検査対象の血液 1.0 μl 中の数百万個の赤血球数に対するカタラーゼ数の比率です。

試薬: 1) 1% H 2 O 2 溶液; 2) 10%硫酸溶液; 3) 0.1 M 過マンガン酸カリウム溶液 (滴定用)。

研究対象:血液を蒸留水で1:1000の比率で希釈して得られる溶血液。

準備 : 10 ml の蒸留水を 100 ml メスフラスコに注ぎ、マイクロピペットを使用して 0.1 ml の血液を加えます。ピペットを同じ溶液で数回洗浄します。フラスコに水を標線まで加え、ストック血液溶液（1:1000）を取得し、これをカタラーゼ数の測定に使用します。

進捗。

7 ml の水を 2 つの滴定フラスコ (実験用および対照用) に注ぎ、それぞれに 1 ml のストック血液溶液を加えます。各フラスコに正確に 2 ml を加えます。コントロールフラスコに 3 ml を加えてカタラーゼを切断します。両方のフラスコを室温で 30 分間インキュベートします。次に、10% 硫酸溶液 3 ml を試験フラスコに注ぎます。両方のフラスコの内容物を、ピンク色が現れるまで過マンガン酸カリウムの０．１Ｍ溶液で滴定する。実験結果と対照結果の差を1.7倍して血中カタラーゼ数を求めます。

計算例：Hのモル当量 2O2 17 g に相当します。これは、1 ml の 0.1 M 溶液には 1.7 mg の H が含まれることを意味します。 2O2 ; 対照フラスコと実験フラスコの内容物を滴定するために使用した0.1M過マンガン酸カリウム溶液のml量の差に1.7を掛けると、mg Hの量が得られます。 2O2 、これは検査対象の血液 1 μl に分割されます。つまり、カタラーゼ数がすぐに計算されます。

規格: カタラーゼ数10～15単位の範囲で、

カタラーゼ指示薬は 2-3x10 -:6 、クリニックでより頻繁に使用されます

臨床的および診断的重要性。高いカタラーゼ活性は、悪性貧血や大球性貧血、またアルコール、カフェイン、アセトン体が体内に導入された場合に観察されます。がん、貧血、結核などの病気では、血液中のカタラーゼ活性が低下します。

2) モリブデン酸アンモニウムを使用

カタラーゼは、系統発生的に体の抗酸化システムの最も古い酵素の 1 つで、酸化還元反応を触媒する酸化還元酵素のクラスに属し、H を基質として使用するヒドロペルオキシダーゼのグループの一部です。 2O2(2H2O2→2H2O+O2) ) または有機ヒドロペルオキシドであるため、カタラーゼとともにペルオキシダーゼ活性を持っています。構造的には、4 つのヘム基を含むヘムタンパク質です。カタラーゼは細胞内酵素です。循環血液では、酵素の大部分は赤血球の細胞質に局在しています。

カタラーゼの機能:

好気性デヒドロゲナーゼの機能の結果として生成される内因性過酸化水素から身体を保護することに関与します。

ヒドロキシルラジカルの生成を抑制します。

ヘモグロビンを酸化から守り、体内の酸素移動を促進します。細胞構造;

特定のアミノ酸の酸化代謝に参加します。

多くの酵素や機能的に活性なタンパク質の活性中心に含まれるSH基を含むSH基を酸化から保護します。

方法の原理。カタラーゼ活性は、モリブデン酸アンモニウム塩と有色の錯体を形成することができる基質（過酸化水素）の酵素の変換によって決定されます。

試薬。 1) 0.03% H 2 O 2 溶液 ; 2) 4% モリブデン酸アンモニウム溶液。

生物材料:血清。

進捗。実験サンプル: 0.1 mlの血清を2.0 mlの0.03%過酸化水素溶液に加えます。でブランクサンプルホエーの代わりに蒸留水0.1ml。で対照サンプル過酸化物の代わりに 2.0 ml の蒸留水を加えます。サンプルを 37 ℃で 10 分間インキュベートします° 次いで、４％モリブデン酸アンモニウム溶液１．０ｍｌを加えて反応を停止する。4000 rpm で 10 分間遠心分離します。 410 nm の波長で、対照サンプルに対するブランクサンプルと実験サンプルの光学濃度を測定します。

計算血清中のカタラーゼ活性:

A (mkat/l) = 、

ここで E op と E cold - 実験サンプルとブランクサンプルの消滅、

3.1 一般的な繁殖,

T - インキュベーション時間、s、

V - 導入されたサンプルの体積、l、

22,210 3 消衰係数、ミリモル1cm1。

血清カタラーゼ活性 2.6+ 0.5ミリカット/リットル

作品の登録。

方法の原理を書き留めます。結果を記録し、結論を導き出します。

カタラーゼは、動植物のほぼすべての生体物質に存在する非常に一般的な呼吸酵素です。

として呼吸する過程で副産物物質が酸化すると過酸化水素が生成されます。高濃度細胞質に対する毒性効果。過酸化物の中和は、カタラーゼ酵素 (その機能の 1 つ) の関与によって起こり、次の方程式に従って過酸化物を水と分子状酸素に分解します。

カタラーゼ

2H2O2 2H2O+O2

カタラーゼの活性は、過酸化水素の分解の結果として放出される酸素の量によって判断されます。

測定には、カタラーゼ、容量 50 ml のビュレット、およびガラス球で構成された装置を使用します。これらはゴム管とガラス製のティーで接続されており、ティーの端にはねじロックが付いています。。ビュレットとガラス球は三脚に取り付けられています。蒸留水を半分の量まで満たします。

進捗

葉0.5gを珪砂を入れた磁器乳鉢で粉砕し、チョーク0.5gを加えて作ります。アルカリ反応(この酵素には pH=7.7 が最適です)。

こすりながら、水20mlを少しずつ注ぎ、混合物をカタラズニクの片方の膝に塗ります。 5 ml の 3% 過酸化水素をもう一方の膝に置きます。カタラズニクはゴムチューブに接続されており、液体の混合を防ぎます。

クランプを開いて漏斗を動かし、ビュレット内の水位をゼロに設定します。クランプを閉じ、カタラーゼの位置をすばやく変更し、両方のエルボで液体を混合します。次に、ビュレット内の水位を下げるためにカタラズニクを常に振って、原料質量 1 g あたり 3 分以内に放出される酸素の量を ml で記録します。

実験中、カタラズニクを手のひら全体で持つことはできません。手で加熱するとフラスコ内の空気が膨張し、測定値の精度に影響を与える可能性があるためです。計数するときは、丸型漏斗とビュレット内の水が同じ高さになるようにしてください。

上段と下段の葉のカタラーゼ活性を測定する。悪影響に対する熟成能力が異なるさまざまな種類の農作物の新芽を使用することもできます。

実験の結果がテーブルに入力されます。

材料と設備

1) 数段の葉、小麦の芽、またはその他の作物を持つ植物。 2）洗浄された川砂。 3）チョークパウダー。 4) 3% 過酸化水素溶液; 5）磁器製乳鉢と乳棒。 6) 25 ml メスシリンダー; ７）カタラーゼを測定するための装置。 8) 見る。 9) 重り付きスケール。

方法の原理:モリブデン酸アンモニウムと過酸化水素溶液は黄色の錯体化合物を形成します。カタラーゼは、次の式を使用して過酸化水素を分解します。

2H 2 O 2 = 2H 2 O + O 2

溶液の色の強度の低下の程度はカタラーゼの活性に比例します。

進捗：４ｍｌの０．０３％過酸化水素溶液を試験管および対照管に添加し、０．２ｍｌの溶血血液（１：１０００希釈）を試験管に添加する。サンプルを３７℃で２０分間阻害する。次いで、２ｍｌのモリブデン酸アンモニウム溶液を両方の試験管に加え、さらに０．２ｍｌの溶血物を対照管に加える。かき混ぜる。青色フィルターを使用して、水に対する実験サンプルと対照サンプルの光学密度を測定します。カタラーゼ活性は次の式を使用して決定されます。

(E k – E 0)。 5600

A= -------------------、ここで

A – カタラーゼ活性 (血液 1 ml あたりのμmol H 2 O 2 /分)。

E k – 制御の消滅。 E 0 – 経験の消滅。

B – インキュベーション時間、分。 5600 – 係数

通常、カタラーゼ活性は 1 ml あたり 135 μmol H 2 O 2 /分です。

血液（唾液中 – 12～16 μmol）。貧血により血液中のカタラーゼ活性が低下することがあります。腫瘍の増殖、結核、その他の病気、急性疾患の増加炎症過程（唾液中 - 口腔粘膜の炎症過程中）。

以下に合理的かつ簡潔に答えてください。

1. CH 3 - CH 2 - CH 2 - OH ® の酸化は起こりますか?

無酸素環境ではCH 3 - CH 2 - CH = O? そのためにはどのような条件が必要なのでしょうか？反応図を書きます。

2. 無酸素環境では、CH 3 - CH 2 - CH = O ® CH 3 - CH 2 - COOH タイプの酸化が起こりますか?また、どのような条件下で起こりますか? 必要な成分を示し、反応図を作成します。反応生成物中に 2 つの酸素原子が現れることを説明する方法。

3. 酸素は、組織呼吸連鎖および一般的な生物学的酸化における水素の排他的（唯一）の最終受容体ですか？

4. 生物の酸化が体外の燃焼と同一視されたのはなぜですか? 名前外部の標識体内の燃焼と酸化プロセスの類似点。これらのプロセスの違いに名前を付けてください。

5. 化合物の脱水素反応を書きます。

R-CH2-CH2-R; R-CH=O; R-CHOH -R; R-CH=CH-R

6. 一致:

酸化還元電位:A.+0.82; B. +0.10; V.+0.25; G.- 0.22

CPE 成分: 1. ユビキノン; 2.酸素; 3.FMN; 4. シトクロム

7. 次の化合物のうち、FAD 依存性デヒドロゲナーゼの基質はどれですか: グルコース、スクロース。コハク酸; グリセルアルデヒド、NADH+。

8. イソクエン酸から酸素への電子とプロトンの移動（イソクエン酸デヒドロゲナーゼ - NAD 依存酵素）の図を書き、次のことを示します。

すべての酵素複合体の名前。

9. 薬– バルビツル酸誘導体:

A. 催眠効果があります。

B. 組織呼吸を活性化します。

B. NADH デヒドロゲナーゼを阻害します。

D. 低エネルギー状態を引き起こす。

酵素は生化学反応のタンパク質触媒であり、そのほとんどは酵素が存在しない場合には非常にゆっくりと進行します。とは異なり化学触媒各酵素は非常に少数の反応のみ、多くの場合 1 つだけの反応を触媒できます。

したがって、酵素は反応特異的な触媒です。ほとんどすべての生化学反応は酵素によって触媒されます。

多くの酵素には、触媒作用特定の熱安定性低分子量の存在下でのみ基材上で有機化合物– 補酵素。

このような場合、ホロ酵素 (触媒活性複合体) はアポ酵素 (タンパク質部分) と関連補酵素から構成されます (付録 H)。補酵素は、共有結合および非共有結合によってアポ酵素に結合することができます。「補欠分子族」という用語は、共有結合した補酵素を指す。補酵素の存在を必要とする反応には、酸化還元、基移動、異性化、および縮合反応が含まれます (IUB システムによれば、これらはクラス 1、2、5、6 です)。切断反応は補酵素の非存在下で発生します (IUB システムによれば、これらはクラス 3 および 4 です)。

^ 4.1 実験室作業「アミラーゼ活性の測定」
ヴォルゲムート法によるモルト」

Wolgemut の方法は、特定の条件下で 1 ml の 0.1% デンプン溶液を完全に加水分解できる酵素の最小量を決定することに基づいています。麦芽のアミラーゼ活性は、1 mlの麦芽抽出物により38℃、30分間加水分解できる0.1%デンプン溶液のミリリットル数で表されます。通常のアミラーゼ活性は 160 ～ 320 活性単位です。

ウォルゲマス法は以下の分野で広く使用されています。臨床実践血液と尿のアミラーゼ活性を測定するため、醸造においては麦芽のアミラーゼ活性を測定するため。急激な上昇血液および尿中のアミラーゼ活性 (10 ～ 30 倍) が観察されます。急性膵炎、膵臓腫瘍。

^ 材料と試薬: 穀物麦芽から抽出し、10倍に希釈します。 0.1%デンプン溶液; 0.2%ヨウ化カリウム溶液中の0.1%ヨウ素溶液。

装置：試験管、ピペット、スポイト、サーモスタットを備えたスタンド。

^ 作業の進捗状況。 10本の試験管に1mlの蒸留水を満たします。 10倍に希釈した抽出液1mlを1本目の試験管に加えて混合し、その混合液1mlを2本目の試験管に移します。この試験管の内容物を再度混合し、1 ml を 3 番目の試験管に移し、以下同様に 10 番目の試験管まで移します。最後の試験管から1mlを取り出し、注ぎ出します。したがって、後続の各試験管では、酵素含有量は前の試験管の 2 分の 1 になります。 10 本の試験管における抽出物の希釈は、1:10 になります。 1:20; 1:40; 1:80; 1:160; 1:320; 1:640; 1:1280; 1:2560; 1:5120; 1:10240。

次に、水 1 ml とデンプン溶液 2 ml をすべての試験管に加え、混合し、一定の温度のサーモスタットに置きます。 38℃で30分間。インキュベーション後、チューブを水道水で冷却して酵素の作用を止め、ヨウ素溶液を 2 滴加え、よく振って色の変化を観察します。ヨウ素と反応すると、液体は黄色、ピンク、紫に変わります。

最小の酵素含有量でデンプンの完全な加水分解がどの希釈で起こったかを記録し（内容物が黄色がかった色の試験管）、抽出物のアミラーゼ活性は、この試験管内の希釈されていない抽出物（A）の量から計算されます。
(1 ml の抽出物は X ml の 0.1% デンプン溶液を分解します)。

例えば、黄色 4 番目の試験管に抽出液が入り、そこで抽出物が 160 倍に希釈されました。この量の抽出物は 2 ml の 0.1% デンプン溶液を加水分解することができ、同じ条件下で 1 ml の未希釈抽出物は 320 ml を加水分解します: X = 2 × 160/1。したがって、アミラーゼ活性は320となります。

^ 4.2 実験室作業「カタラーゼ活性の測定」

バッハによれば」

この方法は、カタラーゼの作用後に残留する過酸化水素の量を、KMnO 4 溶液を滴定することによって測定することに基づいています。反応は次式に従って進みます

0.1 mol/l 過マンガン酸カリウム溶液 1 ml は過酸化水素 85 mg に相当します。

^ 材料と試薬: カタラーゼの調製（大麦麦芽芽１ｇをリン酸緩衝液６ｍｌとともに磁器製乳鉢で粉砕し、濾過する）。 10% H 2 SO 4 溶液; リン酸緩衝液中の０．１％過酸化水素溶液、ｐＨ＝７．０（０．２ｍｏｌ／ｌＮａＨ２ＰＯ４１３．６ｍｌ中の０．２ｍｏｌ／ｌＮａＨ２ＰＯ４３５．０ｍｌ）； 0.1 mol/l KMnO 4 溶液。

装置： 100 ml フラスコ、ピペット、ビュレット、サーモスタット。

^ 作業の進捗状況。カタラーゼ調製物 2 ml を 2 つのフラスコに加え、10% H2SO4 溶液 1 ml をそのうちの 1 つ (サンプル) に加え、次に過酸化水素溶液 2 ml を各フラスコに注ぎ、38 °C のサーモスタットに 40 分間置きます。。インキュベーション時間が経過した後、10% H 2 SO 4 溶液 1 ml を 2 番目のフラスコ (対照) に加え、過剰なカリウムにより持続的なピンク色が現れるまで、両方の溶液を 0.1 mol/L KMnO 4 溶液で滴定します。過マンガン酸塩。

カタラーゼ活性は、分解された過酸化水素の量 (ml) によって決定され、次の式を使用して計算されます。

どこ
– 0.001 N KMnO 4 溶液による対照サンプルと試験サンプルの滴定結果の差、ml。

Q – 過酸化水素の量 (85 mg)、対応する
0.1 mol/l KMnO 4 溶液 1 ml。

^ 4.3 実験室作業「点滴法」
（クリモフスキーとロジェヴィチによると）」

主に調製物中のα-アミラーゼの存在による澱粉分解活性は、澱粉をヨウ素で染色されていない製品に加水分解する酵素の能力を特徴づけます。 α-アミラーゼとグルコアミラーゼが調製物中に存在する場合、この方法はすべてのデンプン分解酵素の総合的な効果を決定します。

この方法では、デンプン分解活性の単位は、厳密に定義された条件下、温度 30 °C で 1 時間以内に、可溶性デンプン 1 g をヨウ素で染色されない生成物に分解する触媒となる酵素の量とみなされます。 AS のデンプン分解活性は、薬物 1 g、培養物、または溶液 1 cm 3 あたりの表示単位数で表されます。 AC 値は、測定条件下で 1 g の薬物、培養物、または 1 cm 3 溶液によって 1 時間以内に何グラムのデンプンがヨウ素非染色化合物に加水分解できるかを示します。反応の完了はヨウ素試験を使用して視覚的に監視されます。

この方法の感度は、ヨウ素の色の変化を視覚的に検出できる最小時間によって決まります。酵素反応の速度は使用する酵素の量に直接比例し、5 分から 1 時間の間は一定のままである、つまり、反応は 0 次反応則に従うと想定されます。さらに、AC 値に対する緩衝液の pH 値と化学的性質の影響が確立されました。酢酸緩衝液 (pH = 4.7) を使用すると、キノコ調製物の AC 値は、リン酸緩衝液 (pH = 6.0) で測定した場合よりも平均して 1.5 倍高くなります。したがって、真菌培養物の AC 値を決定する場合は、酢酸緩衝液を使用することをお勧めします。

この方法の欠点は、反応の終了を視覚的に判断することが不明確であることです。

^ 材料と試薬: 真菌由来の酵素の場合は、pH=4.7の酢酸緩衝液。細菌由来の酵素の場合は、pH=6.0のリン酸緩衝液。 1% デンプン溶液 (キノコ調製物の分析に使用するデンプン溶液は、分析のために pH = 4.7 でなければなりません) 細菌製剤– 6.0); ヨウ素溶液。ヨウ素の塩基性溶液を調製するために、4.4 gのヨウ化カリウム、1.4 gの金属ヨウ素を、すりつぶした蓋をした風袋ガラスに秤量し、約2 cm 3 の蒸留水を加えます。ガラスを蓋で閉め、内容物を混合し、ヨウ素が溶解した後、溶液をすり込み栓付きの１００ｃｍ３メスフラスコに移す。容量をマークまで蒸留水で満たします。フラスコの内容物は冷暗所に保管されます。塩基性ヨウ素液は製造日から30日以内に使用できます。ヨウ素の作業溶液は主溶液から調製されます。これを行うには、塩基性ヨウ素溶液 20 cm 3 を容量 100 cm 3 のメスフラスコに注ぎ、4.4 g のヨウ化カリウムを加え、溶液の総体積を 100 cm 3 に調整します。ヨウ素使用溶液は、調製後 6 日以内に消費できます。

装置：幅広の試験管、ガラス棒、ピペット、50 ml ビーカー、シャーレ、サーモスタット。

^ 作業の進捗状況。 AC値を決定するには、反応条件を厳密に観察することが重要です。これを行うには、すべての溶液（基質（1％デンプン溶液）、酵素溶液、蒸留水）を最初に30℃の温度に加熱する必要があります。

２５ｃｍ３（１２．５ｍｌ）の量の基質を、ガラス棒が挿入された幅広の試験管に入れる。 30 cm 3 (15 ml) の抽出物と 30 cm 3 (15 ml) の水を別々の試験管に注ぎ、サーモスタットに入れて 30 ℃の温度に保ちます。
10分。

次に、ピペットを使用して、元の酵素溶液 1 ～ 25 cm 3 と対応する量の水を、試験管をサーモスタットから取り外さずに、幅の広い試験管内のデンプン溶液に加えます。混合物は50cm 3 です。酵素抽出物が不活性な場合は、水をまったく加えずに、酵素抽出物を 25 cm 3 だけ加えます。

試験管の内容物を棒で混ぜ、抽出物をデンプン溶液に加えた時間をストップウォッチで記録します。 60 秒ごとに、サーモスタットから取り外さずに、試験管からサンプルを 1 滴採取します。白色磁器プレート上に一滴を置き、この一滴をヨウ素使用溶液の一滴と混ぜ合わせ、色を観察します。デンプンの分解反応は、最初の 10 秒以内にヨウ素を試験溶液の滴と混ぜ合わせたときに色の変化が生じなくなったときに完了したと見なされます。色の変化は、ヨウ素と反応混合物の 2 つの滴の間の接触境界ではっきりと見えます。

デンプンがヨウ素で汚れていない製品に分解されるまでにかかる時間は、10 ～
20分。

加水分解時間が 10 分未満の場合は、加水分解に使用する抽出物の量を減らして測定を繰り返します。より多くの水。加水分解が 20 分以内に完了しない場合も、測定に使用する酵素抽出物を増やし、水を減らして分析を繰り返します。得られた加水分解時間を考慮して、再分析に必要な酵素抽出液の量を計算します。

酵素抽出物が少ない、または多すぎる場合高い活動性、酵素溶液の量が 1 ～ 25 cm 3 では、デンプン加水分解の持続時間が 10 ～ 20 分間保証されないため、分析には 25 cm 3 のデンプン溶液ではなく、より多くまたはより少ない量のデンプン溶液を使用します。たとえば、10 または 40 cm 3 のように、計算式に適切な修正を加えます (通常の 0.25 の代わりに、それぞれ 0.1 または 0.4)。

AS のデンプン分解活性の値 (単位/g) は、次の式を使用して計算されます。

ここで、0.25 は 25 cm 3 の 1% 溶液中のデンプンの量、g です。

60 – 1 時間の換算係数。

N は反応に関与する酵素の量、g または cm 3 (この値は最初の抽出物の濃度とその後の希釈を考慮して決定されます)。

T – デンプンがヨウ素で染色されていない製品に分解される時間、分。

例。真菌の空気培養物の酵素抽出物が分析のために採取されました。ストック溶液は、１００ｃｍ３の緩衝水中５ｇの培養物の割合で調製した。この培養物は非常に活性であることが知られているため、元の溶液をさらに希釈しました。20 cm 3 をメスフラスコに入れ、蒸留水を加えて 50 cm 3 にし、そこから 2 cm 3 を分析用に採取しました。次の希釈順序が得られました。

5g→100cm3→20cm3→50cm3→2cm3。

０．２５デンプン（１％デンプン溶液２５ｃｍ３）を最後の希釈液（２ｃｍ３）の酵素溶液で加水分解するのに１２分かかった。次に、風乾した作物の AC (単位/g) は次のようになります。

酵素活性を再計算する場合、考慮すべき絶対的な乾燥物質はありません。酵素の調製、湿度を考慮して。計算は次の式を使用して行う必要があります。

ここで、W は培養物または調製物の水分含量です。

^ 4.4 実験室作業「Willstetter法」
および Waldschmidt-Leitz のタンパク質分解の定義
修飾における酵素活性」

この方法は、遊離カルボキシル基の測定に基づいています。アルコール溶液アミノ酸とポリペプチド。

活性（PA）は、pH 7.3 ～ 7.5 の一定量の 5% ゼラチン溶液の加水分解中に形成されるアミン窒素のミリグラム数で表されます。1 g の薬物または 1 cm 3 の酵素溶液中40℃の温度で1時間。

タンパク質分解活性の単位は、1 時間で 1 mg のアミン窒素を生成する酵素の量とみなされます。受け入れられた条件経験。

^ 材料と試薬: 96% エチルアルコール; チモールフタレインの1%溶液; 0.1 N NaOH 溶液; 基質 – 5% ゼラチン溶液; 分析された植物からの抽出物。

タンパク質分解活性を測定するための抽出物の調製: 0.25 g の植物材料のサンプルを磁器乳鉢に入れ、2.5 ml のリン酸緩衝液 (pH = 7.3) で 2.5 分間粉砕し、その後塊を濾過します。

5% ゼラチン溶液 (基質) の調製: 5 g のゼラチンをガラスカップに入れ、15 ～ 20 cm 3 の蒸留水に 20 ～ 30 分間浸しておきます。膨潤したタンパク質を70〜80℃の温度で20〜25cm 3 の緩衝液に注ぎ、ガラス棒で完全に混合します。溶解した部分を 100 cm 3 のメスフラスコに注ぎ、さらに 20 ～ 25 cm 3 の緩衝液を未溶解部分に加え、得られた溶液を再度同じフラスコに移します。 40℃に冷却したゼラチン溶液を同じ温度の緩衝液でマークします。すぐに使えるソリューションゼラチンは 2 ～ 5 °C の温度で冷蔵庫に保管され、2 日以内に分析に使用されます。分析前に、ゼラチン溶液を水浴中で 40 °C の温度に加熱します。

装置： 200～250mlの三角フラスコ、50mlのメスフラスコ、ガラス棒、ピペット、ビュレット、恒温槽。

^ 作業の進捗状況。 pH 7.3 ～ 7.5 のゼラチン 5％溶液 10 cm 3 に試験酵素溶液 2 cm 3 を加え、直ちに反応混合物 1 cm 3 を容量 50 ～ 100 の三角フラスコに移す。 cm 3、20 cm 3 を注ぐ場合 96% エチルアルコールおよび０．２ｃｍ３の１％チモールフタレイン。青色が現れるまで、サンプルを 0.1 N NaOH 溶液で滴定します。

残りのゼラチンと酵素溶液の混合物を加水分解のために温度 40 °C の恒温槽に置きます。３時間後、反応混合物１ｃｍ３を容量５０～１００ｃｍ３の第２のフラスコに移し、そこにまず９６％エチルアルコール２０ｃｍ３および１％チモールフタレイン０．２ｃｍ３を注ぐ。サンプルは、対照バリアントの場合と同様に滴定されます。

PS のタンパク質分解活性の計算は、次の式を使用して実行されます。

ここで、Aは実験中に反応媒体から蓄積されたアミン窒素の量、mlです。

T – タンパク質分解の継続時間、h;

P は、希釈と 1 g の薬物または 1 cm 3 の液体酵素溶液への換算を考慮した係数です。

値 A は次の式を使用して計算されます。

ここで、a は実験サンプル 1 cm 3 の滴定に使用した 0.1 N NaOH 溶液の量、cm 3 です。

そして、対照サンプルについても同様です。

1.4 – 0.1 N アルカリ溶液の量をアミノ酸およびポリペプチドの窒素のミリグラムに変換する係数。

K – アルカリ力価の補正。

(A.N. バッハおよび A.I. オパーリンによる)

体の重要な機能の基礎を形成するさまざまな変化はすべて、特定のタンパク質である酵素という生物学的触媒の関与によって起こります。

酵素のおかげで、生きた細胞の注目すべき特徴の 1 つである、最も複雑な反応を非常に短時間で実行できる能力が現れます。短時間そして比較的低い体温で。生物学的意義この現象はとても素晴らしいです。

酵素の作用を研究するには、生きた組織から酵素を分離する必要があります。通常、この目的には、この酵素が豊富に含まれる容易に入手可能な供給源が選択されます。酵素を溶液中に移すためには細胞壁を破壊する必要があり、ホモジナイザー、乳鉢での粉砕、凍結融解、自己消化などが行われます。通常、細胞壁の破壊は行われます。低温で行われるため、すべての酵素プロセスが組織内で停止します。

酸化還元酵素のグループにはヘム含有酵素が含まれます カタラーゼ、分子状酸素の放出を伴う過酸化水素の分解反応を触媒します。

2H2O2 -- > 2H2O+O2

カタラーゼは、生体のほとんどの組織に存在します。

方法の原理。

過酸化水素はカタラーゼによって分解されます。過剰な過酸化水素は過マンガン酸カリウムで滴定されます。酸性環境。反応は次の方程式に従います。

2 KMnO 4 + 5 H 2 O 2 + 3 H 2 SO 4 -- > 2 MnSO 4 + K 2 SO 4 + 8 H 2 O + 5 O 2

実験では、破壊されずに残っている過酸化水素の量が測定され、対照では - 合計過酸化水素を摂取した（対照サンプル中のカタラーゼは煮沸により不活性化された）。

対照結果から実験結果を差し引くことで、一定時間内に破壊された過酸化水素の量が分かり、カタラーゼの活性を判断することができます。

装置： 1. ストレートビュレット 50ml用、100ml用（各1個）

2. 10mlシリンダー

3. 乳鉢と乳棒

4. 三角フラスコ 200～250ml（2個）

5. 分銅付きテクニカルスケール

6. 10mlピペット「酵素エキス」

7.「H 2 SO 4」をピペットで注入する

8. 沸騰させる水浴

9. スパチュラ

10. 100mlメスフラスコ

11. ファンネル

12. ろ紙

材料： 1. 新鮮な植物材料（ニンジンまたはジャガイモ）

2. 0.1 N H 2 O 2 溶液

3. KMnO4 の 0.1 N 溶液

4. 10% H 2 SO 4 溶液

5. CaCO 3 (結晶)

6. 珪砂

進捗：

2g 生のジャガイモ（またはニンジン）を石英砂とともに乳鉢で粉砕し、2〜3mlの水を徐々に加えます。酸反応を抑えるには、炭酸カルシウムをスパチュラの先端で二酸化炭素の泡の発生が止まるまで加えます。粉砕された塊を定量的にメスフラスコに移し、水を加えて１００ｍｌに調整する。混合物を３０〜６０分間放置し、その後濾過する。

200 ml 三角フラスコに、0.1 N 過酸化水素溶液 25 ml をビュレットから取り、酵素抽出液 20 ml をピペットで加えます。 30分後、10％硫酸溶液5mlを加えて酵素の作用を停止し、混合物を0.1N過マンガン酸カリウム溶液で滴定する（ピンク色が約1分間続くまで）。残りの過酸化水素を滴定するために使用した過マンガン酸カリウム溶液のミリリットル数を記録します。

同時に、対照を酵素溶液（２０ｍｌ）とともに沸騰水浴中で５分間不活化加熱し、冷却後、２５ｍｌの０．１Ｎ過酸化水素溶液をこの溶液に添加する。混合物を３０分間放置し、その後、１０％硫酸溶液５mlを添加し、過マンガン酸カリウムの０．１Ｎ溶液で滴定する。過酸化水素の総量を滴定するために使用される過マンガン酸カリウムのミリリットル数が記録されます。

実験滴定と対照滴定の差から、分解された過酸化水素の量に相当する過マンガン酸塩の量が求められます。 KMnO 4 とH 2 O 2 の反応式によれば、0.1N過マンガン酸カリウム溶液1mlは過酸化水素1.7mgに相当します。

計算例。

１．２５ｇのニンジンから１００ｍｌのカタラーゼ抽出物を調製した。試験サンプルの滴定には 15.5 ml、対照サンプルには 30.2 ml の 0.1 N 過マンガン酸カリウム溶液が必要でした。サンプル中の分解された過酸化水素の量は、30.2-15.5 = 14.7 ml の 0.1 N 過マンガン酸カリウム溶液に相当し、したがって 14.7 * 1.7 = 24.99 mg に相当します。

生のニンジン 1 g には、(24.99*100)/(20*1.25)=99.96 mg の過酸化水素を 30 分で分解し、99.96/30=3.33 mg を 1 分間で分解できる量のカタラーゼが含まれています。なぜなら

1 μmol の過酸化水素は 0.034 mg なので、ニンジン 1 g には 33.3/0.034 = 100 U のカタラーゼが含まれます。

実験室作業その4

酵母細胞からのスクラーゼの調製。酵素作用の特異性。

体の重要な機能の基礎を形成するさまざまな化学変化はすべて、特定のタンパク質である酵素という生物学的触媒の関与によって起こります。

酵素のおかげで、生きた細胞の注目すべき特徴の 1 つである、非常に短時間かつ比較的低い体温で複雑な反応を実行できる能力が現れます。

酵素の性質、作用条件を研究し、酵素の含有量を決定します。さまざまな臓器そしてティッシュには非常に重要正しく理解するために複雑なプロセス体の重要な活動。

酵素の最も重要な特性の 1 つは、特定の基質に対する酵素の作用の特異性です。酵素の触媒特性の特異性は、酵素が原則として特定の物質にのみ作用するという事実に現れます。酵素の厳密な特異性は、立体異性の場合、特定の酵素が 1 つの立体異性体のみの切断を触媒するという事実によっても示されます。酵素の特異性が最も重要です生物学的特性、それなしでは秩序ある代謝は不可能です。

この研究では、基質であるスクロースの酵素スクラーゼによる切断と、ヒトの唾液に含まれる酵素であるアミラーゼによるデンプンの分解のプロセスを調べます。

酵母細胞からのスクラーゼの抽出

材料と試薬:

・プレスイースト – 10g

ホモジナイザー（乳鉢と乳棒）

・珪砂

・蒸留水

進捗

ドライイースト10gを乳鉢に入れ、蒸留水10mlを加え磁器製乳鉢で均質化します。少量細胞壁を破壊する珪砂。次いで、磁器モルタルをホモジネートとともに乾燥キャビネット内に６０℃の温度で３０～４０分間置く。

指定された時間が経過したら、乳鉢を取り外し、冷却し、30 mlの蒸留水を加え、乳鉢の内容物を滑らかになるまで粉砕します。

次に、細胞塊を沈降させるためにホモジナイズ物を 3000 rpm で 15 分間遠心分離します。得られた上清がスクラーゼ抽出物です。