Métodos mecânicos para isolamento de uma cultura pura de aeróbios. Determinação do número de células por semeadura em meio nutriente sólido (método de placa Koch)
8. Métodos para isolamento de culturas puras de microrganismos
O cultivo de microrganismos, além da composição do meio nutriente, é altamente dependente de fatores físicos e químicos (temperatura, acidez, aeração, luz, etc.). Além disso, os indicadores quantitativos de cada um deles não são iguais e são determinados pelas características metabólicas de cada grupo de bactérias. Existem métodos para cultivar microrganismos em meios nutrientes sólidos e líquidos sob condições aeróbicas, anaeróbicas e outras.
Métodos de isolamento de culturas puras de microrganismos aeróbios. Para obter colônias isoladas, durante a aplicação o material é distribuído de forma que as células bacterianas fiquem distantes umas das outras. Para obter uma cultura pura, são utilizados dois grupos principais de métodos:
a) métodos baseados no princípio da separação mecânica de microrganismos;
b) métodos baseados nas propriedades biológicas dos microrganismos.
Métodos baseados no princípio da separação mecânica de microrganismos
Peneirar com espátula segundo Drigalski. Pegue 3 placas de Petri com meio nutriente. Aplique uma gota do material de teste no primeiro copo com uma alça ou pipeta e esfregue com uma espátula sobre toda a superfície do ágar nutriente. Em seguida, a espátula é transferida para o 2º copo e a cultura restante na espátula é esfregada na superfície do meio nutriente. A seguir, a espátula é transferida para o 3º copo e a semeadura é feita da mesma forma. Na 1ª placa cresce o número máximo de colônias, na 3ª - o mínimo. Dependendo do conteúdo de células microbianas no material em estudo, colônias individuais crescem em uma das placas, adequadas para isolar uma cultura pura do microrganismo.
Método de Pasteur (método de diluição). Uma série de diluições sucessivas, geralmente dez vezes maiores, são preparadas a partir do material que está sendo estudado em meio líquido estéril ou solução salina em tubos de ensaio. A seguir, o material é semeado com grama de 1 ml de cada tubo. Supõe-se que em alguns dos tubos de ensaio permanecerão vários microrganismos que podem ser contados quando semeados em placas. Este método permite calcular o número microbiano do material em estudo. (A contagem microbiana é o número de colônias na última placa de crescimento microbiano multiplicado pela taxa de diluição do material).
Obtenção de uma cultura pura por peneiração em profundidade do meio pelo método Koch (método de enchimento). O material de teste em uma pequena quantidade é adicionado a um tubo de ensaio com MPA derretido e resfriado a 45-50°C, misturado, então uma gota do meio nutriente com o material diluído é transferida para um segundo tubo de ensaio com MPA fundido, etc. . O número de diluições depende do número esperado de microrganismos no material em estudo. As diluições preparadas de micróbios são despejadas dos tubos de ensaio em placas de Petri estéreis, marcadas com números correspondentes aos números dos tubos de ensaio. Após a gelificação do meio com o material de teste, os copos são colocados em um termostato. O número de colônias nas placas de meio de cultura diminui à medida que o material é diluído.
Semeadura em loop (semeadura em curso). Pegue uma placa de Petri com ágar nutriente e divida-a em 4 setores, desenhando linhas de demarcação na parte externa do fundo da placa. O material de teste é inserido no primeiro setor por meio de um laço e linhas paralelas são traçadas ao longo de todo o setor a uma distância de cerca de 5 mm uma da outra. Utilizando a mesma alça, sem alterar sua posição em relação ao ágar, desenhe as mesmas linhas nos demais setores da placa. No local onde um grande número de células microbianas caiu no ágar, o crescimento dos microrganismos ocorrerá na forma de uma faixa contínua. Em setores com pequeno número de células, crescem colônias individuais. Alternativamente, soluções de cultura mista diluídas podem ser vertidas sobre a superfície do meio sólido em placas.
Método de filtragem. Baseia-se na passagem do material em estudo por filtros especiais com determinado diâmetro de poro e na separação dos microrganismos contidos por tamanho. Este método é usado principalmente para purificar vírus de bactérias, bem como para obter fagos e toxinas (no filtrado - fago puro, toxina purificada).
Métodos baseados nas propriedades biológicas dos microrganismos
Criando condições ideais para reprodução
Criação de um regime de temperatura ideal para supressão seletiva da reprodução da microflora acompanhante em baixas temperaturas e obtenção de culturas de bactérias psicrofílicas ou termofílicas. A maioria dos micróbios desenvolve-se bem a 35-37°C, a Yersinia cresce bem a 22°C, a Leptospira é cultivada a 30°C. As bactérias termofílicas crescem em temperaturas fora das faixas de temperatura de outras espécies bacterianas associadas (por exemplo, Campylobacter é cultivada a 42°C).
Criando condições para aerobiose ou anaerobiose. A maioria dos microrganismos cresce bem na presença de oxigênio atmosférico. Os anaeróbios obrigatórios crescem em condições que excluem a presença de oxigênio atmosférico (agentes causadores de tétano, botulismo, bifidumbactérias, bacteroides, etc.). Microorganismos microaerófilos crescem apenas com baixo teor de oxigênio e alto teor de CO 2 (Campylobacter, Helicobacter).
Método de enriquecimento. O material em estudo é inoculado em meios nutritivos seletivos que promovem o crescimento de determinado tipo de microrganismo.
Método Shukevich. O material de teste é inoculado na água de condensação do ágar inclinado. Durante a reprodução, formas móveis de micróbios provenientes da água de condensação espalham-se por todo o ágar, como se “rastejassem” em sua superfície. Peneirando as bordas superiores da cultura na água de condensação do ágar recém-cortado e repetindo isso várias vezes, pode-se obter uma cultura pura. Assim, para isolar a cultura de Proteus vulgaris, Clostridium tetani, o material é inoculado em água de condensação no fundo de um tubo de ensaio com meio denso inclinado, sem tocar a superfície do meio. Esses microrganismos são capazes de crescer rastejante (enxameação) na superfície do meio. Os micróbios associados crescem na parte inferior do meio nutriente, e os micróbios proteus e tetânicos na forma de um filme se espalham para cima e ocupam toda a parte inclinada do ágar.
Método de aquecimento. Permite separar bacilos formadores de esporos de formas não esporuladas. Aquecer o material de teste em banho-maria a 80°C durante 10-15 minutos. Nesse caso, as formas vegetativas morrem e os esporos são preservados e germinam quando semeados em meio nutriente adequado.
Método bacteriostático (método de inibição). Com base nos diferentes efeitos de certos produtos químicos e antibióticos sobre os microrganismos. Certas substâncias inibem o crescimento de alguns microrganismos e não têm efeito sobre outros. Por exemplo, pequenas concentrações de penicilina inibem o crescimento de microrganismos gram-positivos e não afetam os gram-negativos. Uma mistura de penicilina e estreptomicina permite libertar fungos filamentosos e leveduras da flora bacteriana. O ácido sulfúrico (solução a 5%) mata rapidamente a maioria dos microrganismos, e o bacilo da tuberculose sobrevive nessas condições. É necessário levar em consideração que muitas vezes os fatores seletivos são incluídos no meio em concentrações bacteriostáticas, para que os microrganismos acompanhantes permaneçam viáveis e ao transferir colônias da cultura em estudo para meios convencionais, podem ser o motivo da obtenção de uma cultura mista.
Uma cultura pura é uma coleção de microrganismos pertencentes à mesma espécie. A obtenção deste material é um ponto de pesquisa necessário na implementação de técnicas de diagnóstico laboratorial. Para isolar culturas puras de bactérias, são utilizados esfregaços de sangue, escarro, fezes e examinados materiais purulentos e outros materiais biológicos. Em condições naturais (ar, água, solo), produtos alimentares e cadáveres (humanos, animais) existem associações de vários tipos de microrganismos.
A separação da cultura pura é importante para um estudo detalhado das propriedades dos micróbios: morfológicas, culturais, bioquímicas e antigênicas. Com base nos resultados desses métodos de pesquisa, é possível estabelecer que o patógeno pertence a uma determinada espécie e tipo, ou seja, realizar sua identificação.
Os princípios da separação biológica de bactérias implicam levar em consideração as características da atividade vital dos micróbios para selecionar os métodos de pesquisa mais adequados. Os métodos selecionados devem corresponder ao patógeno de acordo com determinados parâmetros.
- Tipo de respiração. Entre as bactérias, distinguem-se grupos de representantes aeróbios e anaeróbios. Para obter micróbios anaeróbicos, o material de pesquisa é aquecido. A próxima etapa é cultivar o micróbio em condições anaeróbicas. Os métodos de obtenção de bactérias aeróbias e anaeróbias são diferentes.
- Esporulação. A capacidade de algumas bactérias de formar esporos proporciona proteção e preservação de microrganismos.
- Resistência das bactérias aos efeitos agressivos de álcalis e ácidos. A resistência de alguns tipos de bactérias a essas substâncias garante a máxima purificação do material de teste das impurezas de outras bactérias usando soluções alcalinas ou ácidas.
- Motilidade de organismos bacterianos. Para separar uma cultura pura de microrganismos móveis, são utilizados métodos para separar culturas microbianas em uma gota de condensado.
- A sensibilidade dos microrganismos aos antibióticos, alguns produtos químicos e outros agentes antimicrobianos. Para alguns patógenos, os métodos mais preferidos para isolar culturas usando meios nutrientes seletivos (específicos).
- Antibióticos. Limpe o material de microorganismos adicionais.
- A capacidade das bactérias de penetrar na pele intacta. Esta propriedade é inerente a algumas variedades que possuem fatores de agressão.
- Sensibilidade dos animais a algumas doenças de origem infecciosa.
Técnicas de avaliação de patógenos
Vários métodos são usados para obter culturas puras de células bacterianas. Cada um deles é utilizado em uma situação particular e possui etapas sucessivas e claras de obtenção de colônias do patógeno. Vejamos os mais populares.
Técnica de Pasteur
Representa a diluição de culturas puras em meio para crescimento bacteriano (consistência líquida) para obter uma concentração de 1 célula por volume de líquido. Este método de isolamento é de grande significado histórico.
Técnica Koch
Também conhecida como técnica de “fiação de placa”. É uma diluição do material para pesquisa em ágar (em estado fundido a uma temperatura de 48-50°C). A seguir, a composição resultante é despejada em placas de Petri, onde deve endurecer.
As inoculações geralmente são feitas a partir das últimas 3-4 diluições, pois já existem poucas bactérias. Assim, quando os micróbios crescem em meio nutriente, aparecem colônias isoladas de microrganismos, que nascem de uma única célula-mãe. Então você pode selecionar uma colônia isolada das profundezas do ágar e transferi-la para um meio nutriente fresco. A próxima etapa é a identificação e isolamento do patógeno.
Técnica de Shukevich
É utilizado quando é necessário isolar uma cultura pura de Proteus aeróbios ou quaisquer outros micróbios caracterizados por crescimento “rastejante”. Semeie as culturas em água condensada na base da inclinação do ágar.
Com este método de separação de uma cultura pura, os organismos celulares móveis (Proteus) sobem para o topo da inclinação do ágar e as formas imóveis não mudam a sua localização no meio de inoculação. Ao semear novamente as bordas superiores da cultura germinada, pode-se obter uma cultura bacteriana pura.
Técnica de Drigalsky
O método Drigalski é bastante utilizado no estudo de material biológico por meio da diluição de culturas em tubo de ensaio com caldo ou soro fisiológico.
Próximo passo: uma gota da solução resultante é distribuída uniformemente sobre a superfície do meio alimentar no 1º copo com uma espátula de vidro estéril. Depois, sem queimar a espátula no fogo, semeiam na 2ª e 3ª tigelas. A essência do método Drygalsky é que, a cada semeadura subsequente, a concentração de bactérias (aeróbios) torna-se cada vez menor. Na 3ª placa estão distribuídas de forma bastante separada, cada célula bacteriana dando origem a células clonais (na forma de colónia isolada). Eles são subcultivados em ágar inclinado para acumular patógenos.
Técnica de Weinberg
O isolamento de culturas puras de patógenos anaeróbicos causa certas dificuldades se os microrganismos não morrerem ao entrar em contato com moléculas de oxigênio. A essência da técnica é remover micróbios anaeróbicos (no material) em um meio alimentar fundido (agarosado) levemente resfriado (45-50°C). São realizadas 6 a 10 diluições. Depois vem o próximo passo: é necessário resfriar rapidamente a composição no tubo de ensaio e preencher sua superfície com uma mistura de vaselina e óleo de parafina, que impede a penetração de ar e promove o desenvolvimento de condições anaeróbicas.
Se a semeadura for favorável, no segundo dia germinam colônias isoladas, que podem ser retiradas do tubo de ensaio aquecendo-o com queimador. Da coluna de ágar cortada, as culturas são coletadas usando uma alça para pesquisas futuras. As colônias resultantes são colocadas em meio nutriente líquido, ponto em que as etapas de isolamento de uma colônia de patógenos anaeróbios podem ser concluídas.
Técnica Hungate
É frequentemente usado para isolar micróbios aeróbicos que são altamente sensíveis ao oxigênio. Para realizar esse isolamento da cultura aeróbia, utiliza-se a técnica de rotação de tubos de ensaio.
Os métodos para inocular bactérias aeróbias envolvem a sua criação em meio de ágar fundido. A presença de um gás inerte num tubo de ensaio torna possível o crescimento de colunas isoladas de bactérias aeróbias de tal forma que as culturas aeróbias isoladas podem ser claramente vistas mesmo a olho nu durante 2-3 dias.
Micromanipulador
Esta é uma técnica para isolar células bacterianas individuais usando um micromanipulador. Um micromanipulador é um dispositivo especial que pode ser usado para capturar uma célula de uma suspensão e também fornecer a capacidade de inocular a cultura em um tubo de ensaio.
A identificação adicional do patógeno é realizada levando em consideração todas as propriedades listadas do patógeno (aeróbios e anaeróbios), bem como as características de sua interação com diversas substâncias.
Em uma série de diluições sucessivas de dez vezes da amostra de teste das últimas 2 diluições (o grau de diluição depende do número de UFC em 1 dose do medicamento de teste), 0,1 ml da suspensão microbiana é semeado em placas de Petri com um nutriente médio (2 xícaras para cada diluição). A suspensão é distribuída uniformemente sobre a superfície do meio usando uma espátula de Drigalski ou esferas de vidro até que a suspensão seja completamente absorvida (seca). Os pratos são tampados e colocados de cabeça para baixo no forno de incubação.
As culturas são incubadas a uma temperatura de (37 1) o C durante 24–96 horas em condições adequadas, dependendo do tipo de microrganismo (aeróbio, microaerófilo ou anaeróbio). Ao incubar em condições anaeróbicas ou microaerófilas, as placas de Petri com colheitas são colocadas em um anaeróstato e a atmosfera gasosa necessária é criada.
Este método pode ser usado para determinar o número de bactérias vivas de cada espécie em probióticos multicomponentes, desde que as bactérias incluídas na preparação formem colônias que sejam visualmente distinguíveis pela forma e outras características.
1.2. Método de copo profundo
Em uma série de diluições sucessivas de dez vezes da amostra de teste das últimas 2 diluições (o grau de diluição depende do número de UFC na preparação de teste), 1,0 ml de suspensão microbiana é adicionado em placas de Petri com diâmetro de 90 mm usando uma pipeta estéril com capacidade para 1,0 ml (2 xícaras para cada diluição). Adicione 20–25 ml de meio nutriente ágar derretido e resfriado a uma temperatura de 42,5 ± 2,5 o C, feche e misture rapidamente e cuidadosamente com movimentos rotacionais e translacionais, sem levantar o fundo do copo da superfície da mesa e evitando que o meio fique na tampa do copo. Após a solidificação do ágar, as placas de Petri são viradas de cabeça para baixo e incubadas em condições adequadas a uma temperatura de (37 1) o C pelo tempo necessário para o microrganismo em questão.
Contabilização de resultados
No final da incubação, as colônias cultivadas em placas de Petri são contadas e o conteúdo de bactérias vivas em 1 dose da amostra de teste é calculado. Na contagem, foram levadas em consideração placas nas quais cresceram pelo menos 15 colônias.
Exemplo de cálculo conteúdo de células microbianas vivas em 1 dose da amostra de teste:
– a partir de uma diluição de 10 -7 cresceram 42 e 45 colônias; a média aritmética é (42+45): 2 = 43,5;
– a partir de uma diluição de 10 -6 cresceram 410 e 450 colônias; a média aritmética é (410+450): 2 = 430;
– o número de bactérias vivas em 1 dose é igual a:
(43,5 ∙ 10 7 + 430 ∙ 10 6) : 2 10 = 4325000000 = 4,3 ∙ 10 9 .
Multiplicar a média aritmética do número de colônias pelo grau de diluição e, se a semeadura em placa de Petri for feita no volume de 0,1 ml, multiplicar por um fator de 10 para converter para 1,0 ml.
Método de limitação de diluições seguida de semeadura em meio nutriente líquido e semilíquido
Método do tubo de ensaio dos números mais prováveis (determinação do número de lactobacilos acidófilos vivos)
Em uma série de diluições sucessivas de dez vezes da amostra de teste 10 -6, 10 -7, 10 -8, 10 -9 (o grau de diluição depende do número de UFC na amostra de teste), 1 ml de suspensão microbiana de cada diluição é inoculada em 2 tubos de ensaio com 9 ml de leite desnatado estéril. Observa-se de qual diluição foi feita a colheita. Uma diluição de 10 -6 do medicamento em solução de cloreto de sódio a 0,9% corresponde a uma diluição de 10 -6 no leite. Para controlar o meio, adicione 4 tubos de ensaio não inoculados com leite. Os tubos inoculados e de controle são incubados a uma temperatura de (38 1) 0 C por 3–4 dias.
Ao final da incubação, é determinado o número de tubos de ensaio com leite coalhado. Os esfregaços são preparados a partir do coágulo de cultura e corados com Gram. Se bactérias características forem visíveis nos esfregaços e não houver microflora estranha, então esta diluição é considerada como contendo microrganismos deste tipo. No caso de fermentação do leite em tubos de controle e se for detectada microflora estranha em esfregaços, o controle é realizado em um novo lote de meio.
Contabilização de resultados
Ao calcular o número de indivíduos vivos, utiliza-se a tabela de McCready (Tabela 1). Primeiro, uma característica numérica é compilada. É composto por 3 números: em primeiro lugar (à esquerda) coloque um número igual ao número de tubos de ensaio com leite coalhado retirados na última diluição onde o leite foi coalhado em todos os tubos de ensaio (por exemplo, 2 tubos de ensaio de diluição 10 -6).
Os próximos dois números indicam o número de tubos de ensaio com leite coalhado em 2 diluições subsequentes (por exemplo, em 1 tubo de ensaio com diluição 10 -7 e em 1 tubo de ensaio com diluição 10 -8).
A característica numérica do resultado será 211.
Utilizando a tabela de McCready, encontre o número provável correspondente à característica digital obtida (no nosso caso, 13), multiplique-o pela diluição, que corresponde ao primeiro dígito da característica numérica (neste exemplo, 10 -6). Então o número de microrganismos vivos em 1 dose é 13 ∙ 10 6 = 1,3 ∙ 10 7.
Tabela 1 Tabela McCready usada no cálculo do número de lactobacilos acidófilos vivos
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Característica numérica |
O número mais provável de microrganismos quando inoculados em 2 tubos paralelos |
77288 0
Propriedades culturais de bactérias
As propriedades culturais (ou macromorfológicas) incluem características do crescimento de microrganismos em meios nutrientes sólidos e líquidos. Na superfície de meio nutriente denso, dependendo da semeadura, microrganismos podem crescer na forma de colônias, estrias ou gramado contínuo.Uma colônia é uma coleção isolada de células do mesmo tipo que cresceu a partir de uma célula (clone de células). Dependendo de onde o microrganismo cresce (na superfície de um meio nutriente denso ou em sua espessura), as colônias superficiais, profundas e inferiores são diferenciadas.
As colônias cultivadas na superfície do meio são diversas: são específicas da espécie e seu estudo é utilizado para determinar as espécies da cultura em estudo.
Ao descrever as colônias, as seguintes características são levadas em consideração:
1) o formato da colônia - redondo, amebóide, rizóide, irregular, etc.;
2) tamanho (diâmetro) da colônia - muito pequena (pontiaguda) (0,1-0,5 mm), pequena (0,5-3 mm), média (3-5 mm) e grande (mais de 5 mm de diâmetro);
3) a superfície da colônia é lisa, áspera, dobrada, enrugada, com círculos concêntricos ou estriada radialmente;
4) perfil da colônia - plano, convexo, cônico, craterizado, etc.;
5) transparência - opaca, fosca, brilhante, transparente, pulverulenta;
6) cor da colônia (pigmento) - incolor ou pigmentada (branca, amarela, dourada, vermelha, preta), notando-se principalmente a liberação de pigmento no meio com sua coloração;
7) borda da colônia - lisa, ondulada, recortada, franjada, etc.;
8) a estrutura da colônia - homogênea, de granulação fina ou grossa, entremeada; a borda e a estrutura da colônia são determinadas usando uma lupa ou em baixa ampliação de um microscópio, colocando uma placa de Petri com a inoculação na mesa do microscópio com a tampa voltada para baixo;
9) consistência da colônia; determinado tocando a superfície com uma alça: a colônia pode ser densa, macia, transformando-se em ágar, mucosa (se estende atrás da alça), frágil (quebra facilmente ao entrar em contato com a alça).
As colônias profundas geralmente se parecem com lentilhas mais ou menos achatadas (formato oval com pontas pontiagudas), às vezes pedaços de algodão com protuberâncias semelhantes a fios no meio nutriente. A formação de colônias profundas é frequentemente acompanhada pela ruptura do meio denso se os microrganismos liberarem gases.
As colônias inferiores geralmente se parecem com finas películas transparentes espalhadas pelo fundo.
As características da colônia podem mudar com a idade, dependendo da composição do meio e da temperatura de cultivo;
O crescimento de microrganismos em meio nutriente líquido é levado em consideração usando culturas de quatro a sete dias cultivadas em condições estacionárias.
Em meios nutrientes líquidos, com o crescimento de microrganismos, observa-se turbidez do meio e formação de filme ou sedimento.
Ao crescer em meio nutriente semilíquido (0,5-0,7% ágar), os micróbios móveis causam turbidez pronunciada, as formas imóveis crescem apenas durante a semeadura por injeção no meio.
Freqüentemente, o crescimento de micróbios é acompanhado pelo aparecimento de odor, pigmentação do ambiente e liberação de gases. O odor característico das culturas de alguns tipos de bactérias está associado à formação de vários ésteres (acetato de etila, acetato de amila, etc.), indol, mercaptano, sulfeto de hidrogênio, escatol, amônia, ácido butírico.
A capacidade de formar pigmentos é inerente a muitos tipos de microrganismos. A natureza química dos pigmentos é diversa: carotenóides, antocianinas, melaninas. Se o pigmento for insolúvel em água, apenas a placa cultural fica manchada; se for solúvel, o meio nutriente também fica colorido. Acredita-se que os pigmentos protegem as bactérias dos efeitos nocivos da luz solar, razão pela qual existem tantas bactérias pigmentadas no ar, além disso, os pigmentos estão envolvidos no metabolismo desses microrganismos;
Na natureza, existem as chamadas bactérias fosforescentes, cujas culturas brilham no escuro com uma luz esverdeada-azulada ou amarelada. Essas bactérias são encontradas principalmente na água do rio ou do mar. Bactérias luminosas - fotobactérias - incluem bactérias aeróbicas (vibrios, cocos, bastonetes).
Isolamento de culturas puras de microrganismos
Uma cultura pura é uma cultura que contém microrganismos da mesma espécie. O isolamento de culturas puras de bactérias é etapa obrigatória da pesquisa bacteriológica na prática laboratorial, no estudo da contaminação microbiana de diversos objetos ambientais e, em geral, em qualquer trabalho com microrganismos.O material em estudo (água, solo, ar, alimentos ou outros objetos) geralmente contém associações de micróbios.
O isolamento de uma cultura pura permite estudar as características morfológicas, culturais, bioquímicas, antigênicas e outras, cuja totalidade determina a espécie e o tipo do patógeno, ou seja, é feita a sua identificação.
Para isolar culturas puras de microrganismos, são utilizados métodos que podem ser divididos em vários grupos:
1. Método de Pasteur - diluição sequencial do material de teste em meio nutriente líquido até a concentração de uma célula no volume (tem significado histórico).
2. Método Koch (“fiação de placas”) - diluição sequencial do material de teste em ágar fundido (temperatura 48-50 C), seguida de despejo em placas de Petri, onde o ágar solidifica. As inoculações são feitas, via de regra, a partir das últimas três ou quatro diluições, onde as bactérias tornam-se poucas e posteriormente, à medida que crescem nas placas de Petri, aparecem colônias isoladas, formadas a partir de uma célula-mãe inicial. A partir de colônias isoladas nas profundezas do ágar, uma cultura pura de bactérias é obtida por subcultura em meio fresco.
3. Método Shukevich - usado para obter uma cultura pura de Proteus e outros microrganismos com crescimento “rastejante”. O material de teste é inoculado em água de condensação na base da inclinação do ágar. Micróbios móveis (Proteus) são capazes de subir no ágar inclinado, formas imóveis permanecem para crescer abaixo, no local da semeadura. Ao semear novamente as bordas superiores da cultura, você pode obter uma cultura pura.
4. Método de Drigalsky - amplamente utilizado na prática bacteriológica, no qual o material de teste é diluído em um tubo de ensaio com solução salina estéril ou caldo. Uma gota do material é adicionada ao primeiro copo e espalhada sobre a superfície do meio com uma espátula de vidro estéril. Depois, com a mesma espátula (sem queimar na chama do queimador), faz-se a mesma semeadura na segunda e terceira xícaras.
A cada inoculação de bactérias, fica cada vez menos na espátula e, ao semear no terceiro copo, as bactérias serão distribuídas pela superfície do meio nutriente separadamente umas das outras. Após 1-7 dias mantendo as placas em termostato (dependendo da taxa de crescimento dos microrganismos), na terceira placa, cada bactéria produz um clone de células, formando uma colônia isolada, que é subcultivada em ágar inclinado para acumular uma cultura pura.
5. Método de Weinberg. Surgem dificuldades particulares ao isolar culturas puras de anaeróbios obrigatórios. Se o contato com o oxigênio molecular não causar imediatamente a morte celular, a semeadura é realizada pelo método Drigalsky, mas após isso as placas são imediatamente colocadas em um anaeróstato. No entanto, o método de criação é mais utilizado. Sua essência reside no fato de a diluição do material em estudo ser realizada em meio nutriente ágar fundido e resfriado a 45-50 oC.
São feitas 6 a 10 diluições sucessivas, então o meio nos tubos de ensaio é rapidamente resfriado e a superfície é coberta com uma camada de uma mistura de parafina e vaselina para evitar que o ar penetre na espessura do meio nutriente. Às vezes, o meio nutriente, após a semeadura e mistura, é transferido para tubos Burri estéreis ou pipetas capilares Pasteur, cujas extremidades são seladas. Com uma diluição bem-sucedida, colônias isoladas de anaeróbios crescem em tubos de ensaio, tubos Burri e pipetas Pasteur. Para garantir que as colônias isoladas sejam claramente visíveis, são utilizados meios nutrientes clarificados.
Para extrair colônias isoladas de anaeróbios, o tubo é levemente aquecido girando-o sobre uma chama, enquanto o ágar adjacente às paredes derrete e o conteúdo do tubo na forma de uma coluna de ágar desliza para uma placa de Petri estéril. A coluna de ágar é cortada com uma pinça estéril e as colônias são removidas com uma alça. As colônias extraídas são colocadas em meio líquido favorável ao desenvolvimento de microrganismos isolados. O meio ágar é expelido do tubo Burri passando o gás através de um tampão de algodão.
6. Método Hungate. Quando se deseja obter colônias isoladas de bactérias com sensibilidade particularmente alta ao oxigênio (eróbios estritos), utiliza-se o método do tubo rotativo Hungate. Para fazer isso, o meio de ágar fundido é inoculado com bactérias em corrente constante através de um tubo de ensaio de gás inerte livre de impurezas de oxigênio. O tubo é então selado com uma rolha de borracha e colocado horizontalmente em uma pinça que gira o tubo; o meio é distribuído uniformemente pelas paredes do tubo de ensaio e solidifica em uma camada fina. A utilização de uma fina camada em um tubo de ensaio preenchido com uma mistura gasosa permite a obtenção de colônias isoladas e claramente visíveis a olho nu.
7. Isolamento de células individuais utilizando um micromanipulador. Um micromanipulador é um dispositivo que permite remover uma célula de uma suspensão usando uma micropipeta ou microloop especial. Esta operação é controlada sob um microscópio. Uma câmara úmida é instalada na platina do microscópio, na qual é colocada a preparação da gota suspensa. As micropipetas (micropoops) são fixadas nos suportes dos suportes operacionais, cujo movimento no campo de visão do microscópio é realizado com precisão micrométrica graças a um sistema de parafusos e alavancas. O pesquisador, olhando através de um microscópio, remove células individuais com micropipetas e as transfere para tubos contendo meio líquido estéril para obter um clone celular.
L. V. Timoschenko, M.V. Chubik
Ambientes especiais.
Em bacteriologia, são amplamente utilizados meios nutrientes secos produzidos industrialmente, que são pós higroscópicos contendo todos os componentes do meio, exceto água. Para a sua preparação, são utilizadas digestões trípticas de produtos não alimentares baratos (resíduos de peixe, farinha de carne e ossos, caseína técnica). São práticos para transporte, podem ser armazenados por muito tempo, dispensam os laboratórios do enorme processo de preparação de meios e os aproximam da resolução do problema de padronização de meios. A indústria médica produz meios secos Endo, Levin, Ploskirev, ágar sulfito de bismuto, ágar nutriente, carboidratos com indicador de PA e outros.
Termostatos
Termostatos são usados para cultivar microorganismos.
Um termostato é um dispositivo que mantém uma temperatura constante. O aparelho é composto por aquecedor, câmara, paredes duplas, entre as quais circula ar ou água. A temperatura é regulada por um termostato. A temperatura ideal para a reprodução da maioria dos microrganismos é de 37°C.
LIÇÃO 7
TÓPICO: MÉTODOS PARA ISOLAR CULTURA PURA DE AERÓBIOS. ETAPAS DE ISOLAMENTO DE CULTURA PURA DE BACTÉRIAS AERÓBICAS PELO MÉTODO DE DISSOCIAÇÃO MECÂNICA
Plano de aula
1. O conceito de “cultura pura” de bactérias
2. Métodos para isolar culturas puras por separação mecânica
3. Métodos biológicos para isolamento de culturas puras
4. Métodos para identificação de bactérias
Objetivo da lição: Familiarizar os alunos com vários métodos de isolamento de culturas puras, ensinar como semear com alça, pinceladas e injeção
Diretrizes para a demonstração
Em seu habitat natural, as bactérias são encontradas em associações. Para determinar as propriedades dos micróbios e seu papel no desenvolvimento do processo patológico, é necessário ter bactérias na forma de populações homogêneas (culturas puras). Uma cultura pura é uma coleção de indivíduos bacterianos da mesma espécie cultivados em meio nutriente.
Métodos para isolar culturas puras de bactérias aeróbias
Método Pasteur Método Koch Biológico Físico
(possui histórico (fiação da placa)
Significado)
Método Químico
Shchukevich
Moderno
Semeando com alça Semeando com espátula
(Método Drigalski)
Métodos para isolar culturas puras:
1. Os métodos de separação mecânica baseiam-se na separação de micróbios por fricção sequencial do material de teste sobre a superfície do ágar.
a) Método de Pasteur - tem significado histórico, prevê a diluição sequencial do material de teste em meio nutriente líquido pelo método de laminação
b) O método de Koch - método da placa - baseia-se na diluição sequencial do material de teste com ágar peptona de carne, seguida do vazamento de tubos de ensaio com o material diluído em placas de Petri.
c) Método Drigalsky - ao semear material ricamente semeado com microflora, use 2-3 xícaras para semeadura sequencial com espátula.
d) Semeadura com laçada em pinceladas paralelas.
2. Os métodos biológicos baseiam-se nas propriedades biológicas dos patógenos.
a) Biológica - infecção de animais altamente sensíveis, onde os micróbios se multiplicam e acumulam rapidamente. Em alguns casos, este método é o único que permite isolar a cultura do patógeno de uma pessoa doente (por exemplo, com tularemia), em outros casos é mais sensível (por exemplo, o isolamento de pneumococo em camundongos brancos ou o patógeno da tuberculose em cobaias).
b) Químico – baseado na resistência ácida das micobactérias. Para libertar o material da flora acompanhante, é
tratado com solução ácida. Apenas os bacilos da tuberculose crescerão, uma vez que os micróbios resistentes aos ácidos morreram sob a influência do ácido.
c) O método físico baseia-se na resistência dos esporos ao calor. Para isolar uma cultura de bactérias formadoras de esporos de
misturas, o material é aquecido a 80°C e inoculado em meio nutriente. Apenas esporos de bactérias crescerão, uma vez que seus esporos permaneceram vivos e deram origem ao crescimento.
d) Método de Shchukevich - baseado na alta mobilidade do Proteus vulgaris, capaz de produzir crescimento rasteiro.
Método para preparar ágar em placa
O MPA é derretido em banho-maria e depois resfriado a 50-55°C. O gargalo da garrafa é queimado na chama de uma lamparina a álcool, as placas de Petri são abertas para que o gargalo da garrafa caiba sem tocar nas bordas da placa, despeje 10-15 ml de MPA, a tampa é fechado, o prato é agitado para que o meio fique bem distribuído e deixado sobre uma superfície horizontal até endurecer. Após a secagem, as placas de ágar são armazenadas no frio.
Semeadura em loop
Usando uma alça estéril resfriada, pegue uma gota de material, abra uma borda do copo com a mão esquerda, traga a alça para dentro e faça algumas pinceladas em um lugar com uma alça na borda oposta, depois rasgue a alça e inocule o material em movimentos paralelos de uma borda à outra do copo com um intervalo de 5-6 mm. No início da semeadura, quando há muitos micróbios na alça, eles darão crescimento confluente, mas a cada passada há cada vez menos micróbios na alça, e eles permanecerão solitários e produzirão colônias isoladas.
Semeando segundo o método Drigalsky
Este método é utilizado na inoculação de materiais fortemente contaminados com microflora (pus, fezes, expectoração). Para semear pelo método Drigalsky, pegue uma espátula e várias xícaras (3-4). Uma espátula é uma ferramenta feita de arame de metal ou dardo de vidro, dobrada em forma de triângulo ou L. O material é introduzido no primeiro copo com uma alça ou pipeta e distribuído uniformemente com uma espátula sobre a superfície do meio com a mesma espátula, sem queimá-lo, o material é esfregado no meio nutriente no segundo copo, e a seguir; no terceiro. Com essa semeadura, a primeira xícara terá crescimento confluente e colônias isoladas crescerão nas xícaras subsequentes.