組換え組織プラスミノーゲン活性化因子。組織および体液から分離されたプラスミノーゲン活性化因子

アントノバ O.P.、マリュギン B.E.

角膜形成術と白内障の同時手術後の線維性ブドウ膜炎の治療における組換え組織プラスミノーゲン活性化因子の使用（臨床例）

1 国立医療研究センター「MNTK」の「Eye Microsurgery」にちなんで名付けられました。アカデミー。 S.N. ロシア連邦保健省の「フェドロフ」

線維性ブドウ膜炎は、白内障手術および角膜形成術の術後に起こる重篤な合併症の 1 つです。前房内にフィブリンが長期間存在すると、術後の経過が変化し、悪化します。周囲の組織、特に移植片の内皮細胞に有毒で機械的な影響を与える危険性があり、虹彩水晶体横隔膜と移植片との間に生じる前結合は、その（移植片）剥離を引き起こす可能性があります。前房に線維素水が存在すると、集中的な局所的および全身的なコルチコステロイド療法が必要となり、視覚リハビリテーションのプロセスが遅れます。長期治療望ましい最終結果が得られない可能性があります。線維性瞳孔膜の形成は、たとえ高度な技術レベルで行われた手術の機能的結果を悪化させ、繰り返しの介入の必要性を引き起こす。

線維性ブドウ膜炎の治療における主な薬剤は、線維素溶解薬とプラスミノーゲン活性化剤であるフィブリノリシン、ストレプトデカーゼ、ウロキナーゼなどです。しかし、ウロキナーゼを除くこれらの薬剤はすべて人体にとって外来のタンパク質であり、多くの場合アレルギー反応を引き起こします。さらに、活性な線維素溶解に必要な用量では、眼の内膜、場合によっては外膜に対して有毒です。

眼科手術における血栓溶解薬グループの最新の薬剤の 1 つは、組換え組織プラスミノーゲン活性化因子 (rTPA) です。 rTPA は同種異系酵素です。その天然の類似体は、目のすべての構造を含む、人体のほぼすべての組織および器官に存在します。したがって、この酵素には抗原性はありません。 rtPA の際立った特徴は、フィブリンに対する高い特異性です。プラスミノーゲンの活性化は病理学的基質（血餅またはフィブリン）の表面でのみ発生しますが、rtPA を使用した場合、全身性線維素溶解の活性化は発生しません。

組換え組織プラスミノーゲン活性化因子を含む酵素アルテプラーゼは、急性心筋梗塞、肺動脈および脳血管の血栓塞栓症などの疾患に顕著な血栓溶解効果をもたらします。外国の科学者は 80 年代に眼科で rtPA を使用した結果を初めて報告しました。前世紀。実験における眼内線維素溶解に対する rtPA の効果の研究と、臨床での単独使用に関するデータに特化した海外の研究が数多くあります。国内文献では、この問題に関する最初の出版物は 1995 年に遡ります。

現在までに、線維性ブドウ膜炎の治療におけるrtPAの使用について、主に海外の研究者によって多くの研究が発表されています。多くの研究で rtPA の有効性が調査されています。さまざまな病態目、その投与方法、薬物の単回投与量およびコース投与量、薬物との適合性伝統的な手法処理。

現代の国内の眼科では、rtPAが術後合併症の治療に使用されることは極めてまれですが、その理由は薬剤費が高いためであり、したがって線維性ブドウ膜炎との闘いにおいて日常的に選択されるものではありません。

目標- 独学で勉強する臨床例術後線維性ブドウ膜炎の治療における組換え組織プラスミノーゲン活性化因子の使用の有効性と安全性。

材料と方法

我々は、白内障を合併したフックス角膜内皮ジストロフィーと診断された77歳の患者1名を診察した。入院時の視力は0.05、角膜厚測定は中心点で650μm、内皮細胞密度は測定できなかった。上記のデータに基づいて、後房 IOL の移植を伴う白内障の水晶体超音波乳化吸引術と後部自動層状角膜形成術という 1 段階の手術を行うことが決定されました。術後初日、角膜は透明で、デスメ膜は一重で、前房は中程度の深さで、前房液は透明で、虹彩は構造的で、IOLは水晶体嚢の中にあり、正しい位置、PEC - 1340 セル/mm 2 。術後最初の 4 日間、目の状態は安定していました。術後の治療は標準的で、抗生物質、コルチコステロイド、降圧薬、角膜保護剤の点滴投与、およびコルチコステロイドの結膜下注射が含まれていました。手術後 5 日目に、生体顕微鏡検査により前眼房内の線維性滲出液が視覚化されました。これはグラフトの端に固定された前癒着を備えた瞳孔膜でした (図 1)。したがって、上記の治療法が調整されました。 1 日あたりの抗生物質とコルチコステロイドの投与量が増加し、散瞳薬、NSAID の点滴投与、およびコルチコステロイドの全身投与が追加されました。

この治療は 15 日間実施されましたが、前向きな変化はありませんでした。前房からの線維素浸出液の吸引を目的とした繰り返しの外科的介入の問題は、移植片剥離のリスクが高いため拒否されました。組換え組織プラスミノーゲン活性化因子（Actilyse、Boehringer Ingelheim Pharma、ドイツ）を使用することが決定された。術後16日目に、rtPAを25μg/ml、0.2mlの量で前房に注入した。提示された薬の投与量の計算は、外国の研究者による多くの研究の結果に基づいています。

結果

次の数時間以内にポジティブな変化が見られました。薬物投与後 3 時間までに、瞳孔膜は半分に減少し、移植片の端に固定されていた前結合組織は完全に消失しました。 rtPA投与後8時間までに、ほぼ完全な吸収が観察され、少量のフィブリンがIOLの前面に残存した。翌日、OCT Visante データによれば、瞳孔膜は IOL の前面に保存されており、その矢状面での寸法は 0.21 ～ 0.28 mm でした。前房へのｒｔＰＡの導入後の移植片の内皮細胞の単層の状態を評価するために、ＰＥＣ計数を実施したところ、１２９０細胞／ｍｍ２、視力０．３であった。 rtPA の投与後 7 日目に、生体顕微鏡検査中に、虹彩の瞳孔端にある IOL の前面にフィブリン膜が観察されました。OCT Visante によれば、残留フィブリンの寸法は次のとおりでした。矢状面 - 0.09 mm、前額面 - 0.54 mm。 PEC - 1310 細胞/mm 2、視力は安定したまま - 0.3。 1ヶ月後 rtPAの投与後、前房の線維性突起が完全に消失し、PEC - 1280細胞/mm 2 、視力 - 0.4。上記の治療と前房へのrtPAの導入を伴う術後期間全体を通して、移植片は透明で固体のままであり、レシピエントの間質の後層に完全に隣接していたことは注目に値します（図2）。 2)。

結論

上記を踏まえて臨床例、rtPAの単回前房内投与により、前房におけるフィブリン吸収のプロセスが何倍も加速されると結論付けることができます。したがって、私たち自身の臨床経験に基づいて、組換え組織プラスミノーゲン活性化因子の使用は、術後の線維性膜を除去する安全かつ効果的な代替手段であると言えます。副作用はなく、悪影響角膜内皮では、rtPAの影響下で線維性突起が完全に解決され、繰り返しの必要がなくなります。外科的介入これにより、移植片脱臼のリスクが軽減され、患者の視覚リハビリテーションが確実に促進されます。残念ながらコストが高いこの薬ほとんどの場合、クリニックでの使用は除外されます。

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血漿線溶系の主成分。プラスミノーゲン活性化因子は、生理学的および病態生理学的な重要性の観点から、天然（生理学的）起源のものと細菌起源のものがあります。

生理学的プラスミノーゲン活性化因子

凝固系と同様に、プラスミノーゲンの活性化には内部経路と外部経路の 2 つの経路があります。

内部機構血液凝固を開始するのと同じ因子、つまり第 XIIa 因子 (活性化ハーゲマン因子) によって引き起こされます。 プレカリクレインそして高分子量 キニノゲン血漿、プラスミノーゲンを活性化します。

血液凝固を活性化する第 XII 因子を介して血漿が異物表面と接触すると、同時に線溶の活性化が引き起こされます。この場合、第 XII 因子の活性化中に、プレカリクレイン (フレッチャー因子) と同一の特殊な血漿プラスミノーゲンプロアクチベーターがプラスミノーゲンアクチベーターに変換され、プラスミノーゲンがプラスミンに活性化されます。

さらに、第 XII 因子に対するタンパク質分解酵素の影響下で、プレアルブミン断片が形成されることが判明しました。これらは、凝固促進剤として、活性化第 XII 因子よりも活性が低いですが、他の 2 種類の活性があります。線維素溶解とキニンの形成を刺激します。第 XII 因子の断片は、プロアクチベーターをプラスミノーゲンアクチベーターに変換します。プラスミノーゲンの直接的な活性化はカリクレインによって引き起こされます。しかし、通常、ヒトの血液中に遊離のカリクレインは存在しません。カリクレインは不活性状態にあるか、阻害剤と結合しているため、カリクレインによるプラスミノーゲンの活性化は、キニン系の活性が大幅に増加した場合にのみ可能です。

したがって、内部パス線維素溶解は、血液凝固後ではなく、血液凝固と同時にプラスミンシステムの活性化を確実にします。形成されるカリクレインとプラスミンの最初の部分が第 XII 因子によるタンパク質分解を受けて断片が分離され、その影響下でプレカリクレインからカリクレインへの変換が増加するため、これは「閉じたサイクル」で機能します。

外部パスのアクティブ化主に以下を通じて実行されます 組織プラスミノーゲン活性化因子(TAP) は血管の内側を覆う内皮細胞で合成されます。同一または非常によく似た活性化因子が、体の多くの組織や体液に存在します。内皮細胞からの組織プラスミノーゲン活性化因子の分泌は一定ですが、トロンビン、多くのホルモン、およびさまざまな刺激の影響下で増加します。薬(アドレナリン、バソプレシンおよびその類似体、ニコチン酸）、ストレス、ショック、組織の低酸素症、外科的外傷。プラスミノーゲンおよび組織プラスミノーゲン活性化因子は、フィブリンに対して強い親和性を持っています。フィブリンが出現すると、プラスミノーゲンとその活性化因子がそれに結合して三元複合体 (フィブリン-プラスミノーゲン-組織プラスミノーゲン活性化因子) を形成します。そのすべての成分は、プラスミノーゲンの効果的な活性化が起こるように配置されます。その結果、プラスミンはフィブリンの表面に直接形成されます。後者はさらにタンパク質分解を受けます。

2 番目の天然プラスミノーゲン活性化因子はウロキナーゼで、腎上皮によって合成されます。これは組織活性化因子とは異なり、フィブリンに対する親和性を持ちません。プラスミノーゲンの活性化は、血栓の形成に直接関与する内皮細胞および多くの血液細胞の表面にある特定の受容体で起こります。通常、血漿中のウロキナーゼのレベルは、組織プラスミノーゲン活性化因子のレベルよりも数倍高くなります。損傷した内皮の治癒におけるウロキナーゼの重要な役割についての報告があります。

組織プラスミノーゲン活性化因子とウロキナーゼは現在、組換え DNA 法によって合成され、医薬品として使用されています。

線維素溶解の細菌活性化因子

線維素溶解の細菌活性化因子には、ストレプトキナーゼおよびスタフィロキナーゼが含まれます。人は生涯を通じて、明らかなまたは隠れた連鎖球菌性およびブドウ球菌性疾患に苦しむことが多いため、ストレプトキナーゼおよびスタフィロキナーゼが血液中に侵入する可能性があります。

ストレプトキナーゼ– 線溶の強力な特異的活性化剤。 A、C グループの溶血性連鎖球菌によって生成されます。

ストレプトキナーゼは、間接的なプラスミノーゲン活性化因子です。それはプラスミノーゲンプロアクチベーターに作用し、それをアクチベーターに変換し、プラスミノーゲンをプラスミンに活性化します。

ストレプトキナーゼとプラスミノーゲンプロアクチベーターの反応は 2 段階で起こります。最初の段階では、プロアクチベーター I からプロアクチベーター II が形成され、2 番目の段階では、プロアクチベーター II がプラスミノーゲンを活性化するアクチベーターに変換されます。

本発明は、体内での半減期が延長され、熱および酸に対する安定性が向上し、血栓領域周囲の炎症を抑制するために使用できる、新規の改良された組織活性プラスミノーゲン（改良されたＴＰＡ）に関する。本発明はまた、組換えＤＮＡ技術を使用して前記組織プラスミノーゲン活性化因子を生成する方法、およびその実施に使用される手段に関する。ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（TPA）は有益な線維素溶解活性を有し、フィブリン結合プラスミノーゲンに対して非常に効果的ですが、体内の自由循環相では従来の血栓溶解剤であるストレプトキナーゼ（SK）ほど効果的にプラスミノーゲンを活性化しないことが知られています。）およびウロキナーゼ（英国）。ヒトＡＰＴのアミノ酸配列およびヒトＡＰＴをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は公知である（Ｐｅｎｎｉｃａ．Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、３０１、２１４－２２１、１９８３）。ヒトAPTは、静脈および動脈の血栓を溶解することも知られています。大規模に臨床研究ヒトAPTを静脈内投与すると、以下の患者の閉塞した冠動脈の再灌流に効果があることに注目した。急性心臓発作心筋。しかしながら、血栓形成に関連する疾患の治療にこの薬剤を使用することの欠点は、血中でのその酵素活性の半減期が非常に短いことである(Rijken, D.C., et al., Thromb. Heamost. 54 (1), ６１、１９８５、Ｈｕｂｅｒｔ、Ｅ．Ｆ．ら、Ｂｌｏｏｄ、６５、５３９、１９８５）。治療に使用する場合、ヒト APT を連続高用量静脈内注射として投与する必要があります。天然のヒトAPTはドメイン構造を持っていることが知られており、分子のN末端からフィンガードメイン、EGFドメイン（上皮成長因子）、2つのドメイン「クリングル1」と「クリングル2」、そしてセリンが存在します。プロテアーゼドーマー。 Rijken らの研究では、ヒト APT の生物学的半減期が短いことがすべてのドメインに関連している可能性があることが指摘されています (Rijken D.C., et al., Thromb. Heamost., 54 (1), 61, 1985)。セリンドメインプロテアーゼを除く、ヒトAPTの。 Zonneveld らの研究。 (Zonneveld, A.J.V., et al, Proc. Natl. Acad. USA., 83, 4670, 1986) は、フィンガードメイン、EFR ドメイン、およびクリングル 2 ドメインが重要天然に存在するヒトAPTのフィブリン結合活性、およびAPTのフィブリン依存性活性化を維持するために。しかし、天然に存在するヒトAPTのフィブリン結合活性とそのフィブリン依存性活性を維持し、生物学的半減期を延長するための具体的な手段はまだ開発されていない。特開昭６２－４８３７８号公報には、天然に存在するヒトＡＰＴのアミノ酸８７～１７５を欠失させ、「クリングル１」を欠失させたＡＰＴが記載されている。この APT は、上皮成長因子領域にさらに誘発された点突然変異によって区別されます。日本特許出願は、修飾APTがフィブリンに結合する能力を有するが、組織プラスミノーゲン活性化因子阻害剤との相互作用が弱められることを開示している。欧州特許第２４１２０８号には、クリングル１も欠失している、天然に存在するヒトＡＰＴのアミノ酸９２〜１７９を欠失させることによって得られるＡＰＴが記載されている。この研究では、このAPTが線溶活性を持っていることが述べられています。さらに、欧州特許第２３１６２４号は、半減期が延長された修飾ＡＰＴを開示している。 F-EGFK2-A配列を有する改変型APTにはクリングル1ドメインが欠如しているが、その具体的な調製方法は示されていない。上記を考慮すると、本発明による修飾APTは、内部ドメインの領域のアミノ酸配列において天然に存在するAPTとは異なっていなければならないことは明らかである。広範な研究の結果、出願人は、フィンガードメイン、EFRドメイン、クリングル2ドメインおよびセリンプロテアーゼドメインを含む改良型APTを取得したが、最初の「クリングル1」ドメインが特定の部位で欠失しており、ドメイン結合部位にはクリングル 2 とセリンプロテアーゼの変異が導入されており、その結果、優れた耐熱性と耐酸性、顕著に延長された生物学的半減期、および顕著な抗炎症活性を示す改良された APT が得られ、その一方で望ましい特性が維持されています。天然に存在するヒトAPT。本発明は、改良されたＡＰＴに関する。本発明によるＡＰＴは、その点で著しく異なる。化学構造天然に存在するヒトAPTから抽出され、優れた特性を示します。本発明による改良されたAPTは、以下で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。一般式図２８〜２９において、Ｒは直接結合であり、ＹはＡ−Ｉｌｅ−Ｂ（ＡはＡｒｇまたはＧｌｕであり、ＢはＬｙｓまたはＩｌｅ）、好ましくはＧｌｕ−Ｊｌｅ−Ｌｙｓである。 H 2 N はアミノ末端を示し、-COOH はカルボキシ末端を示します。本発明において、「改良されたＡＰＴ」という用語は、ＡＰＴの類似体を指すために使用され、ＡおよびＢはそれぞれ以下に記載されるアミノ酸を表す：

改良されたAPT (II): Arg、Lys;

高度な APT (V): Arg、Ile。

高度な APT (VI): Glu、Lys。

改良されたAPT (VIII): Glu、Ile。本発明はまた、組換えＤＮＡ技術を使用した、提案されているＡＰＴ類似体の発現にも関する。これに関連して、改良された APT および組換え DNA 発現ベクターをコードする新しい DNA が開発されました。【図１】改良されたＡＰＴ（ＩＩ）をコードする合成遺伝子の断片を構築するために使用される１６個のオリゴデオキシヌクレオチドの配列を示す図である。図３〜４は、本発明の改良型ＡＰＴ（ＩＩ）を構築するための合成遺伝子の断片であり、制限酵素Ｂｇｅ１１およびＥｃｏＲ１の末端を含み、図１〜２に示す１６個のオリゴデオキシヌクレオチドを使用して構築される。 ; 【図５】改良されたＡＰＴを構築するための方法（ＩＩ）（図中、黒色領域、影付き領域および影なし領域は、それぞれ、成熟ＡＰＴタンパク質をコードする領域、プロプロペプチドをコードする領域、および非翻訳領域を示す。６−ジデオキシ法および７−ＤＥＡＺＡ法を使用してＤＮＡ塩基の配列を決定することによって合成遺伝子ブロックＩＶの断片を試験する方法、図７−動物細胞における発現ベクターｐＶＹ１を構築する方法。ｐＶＹ１における改良型ＡＰＴのＤＮＡの組み込み；図８－１３において、改良型ＡＰＴ（ＩＩ）および改良型ＡＰＴ（Ｖ）をコードするＤＮＡ配列。）および改良されたＡＰＴ（Ｖ）図２０−ＥｃｏＲ１およびＢａｍでｐＢＲ３２２ベクターに組み込まれた、天然ＡＰＴ遺伝子のフラグメントＥｃｏＲ１−Ｘｈｏ（約１０００塩基対）を有するプラスミドｐＴＰＡ２の制限酵素および機能マップ。 H1 切断部位。【図２１】ｍｐ９（遺伝子の断片ＢｇＬ１１－Ｘｈｏ１１（約１５００塩基対）を有し、ＢａｍＨ１切断部位で二本鎖ＤＮＡＭ１３ｍｐ９に組み込まれた改良型ＡＰＴ（ＩＩ））（改良型ＡＰＴ（ＩＩ））。【図２２】フィブリン置換基の存在下（＋Ｆｂ）および非存在下（－Ｆｂ）におけるＳ－２２５１法を使用した、改良型ＡＰＴ（ＶＩ）および天然に存在するＡＰＴのＡＰＴ活性の「用量効果」依存性を示す図である。図２３は、ウサギの血液中の改良型ＡＰＴ（ＶＩ）および天然型ＡＰＴの活性の経時変化を示す図である。図２４は、熱処理後の改良型ＡＰＴ（ＶＩ）の残存活性の変化を示す図である。改良されたＡＰＴ（ＶＩ）によるリンパ球活性化因子（ＬＡＦ）。変性タンパク質を用いた活性化、改良されたＡＰＴ（ＶＩ）。 27 - 改良されたAPTの影響下での変性タンパク質の分解(VI)。組換えDNAおよび形質転換細胞を取得する方法については、以下に詳細に記載する。改善されたAPTを取得する方法。本発明のAPTの由来となる天然APTをコードする遺伝子は、Bowesヒト黒色腫細胞から調製されたcDNAバンクから単離される。ポリ A+ RNA はヒトボウズ黒色腫細胞から単離され、ショ糖密度勾配遠心分離によって分画されました。次に、分画された少量のポリ(A) + RNA が選択され、APT 遺伝子をコードする mRNA 画分が、特定の APT mRNA 配列を認識できるオリゴヌクレオチドプローブを使用したドットハイブリダイゼーションによって同定されます。この APT mRNA に富む画分を出発材料として使用して、cDNA バンクを調製し、上記の APT mRNA 同定プローブを使用してスクリーニングします。 APT遺伝子の完全な配列をもつクローンはまだ単離されていないため、欠落している塩基配列をDNA合成機で合成して目的の遺伝子を取得します。次に、部位特異的突然変異誘発によって目的の遺伝子が構築されます。 Eco R1-Xho 11 フラグメントは APT 遺伝子内に天然に存在し (約 1000 塩基対)、その一部は N= 末端で欠失し、Eco R1 および BamH1 切断部位で pBR332 ベクターに導入され、pTPA2 が生成されます。このプラスミドで大腸菌を形質転換して得られた菌株（大腸菌HB 101/pTPA2）は、工業技術院発酵研究所に寄託されている。登録番号 P-9649 (FERM BP-2107)。プラスミド pTPA2 の制限および機能マップを図 20 に示します。改良されたAPT遺伝子がpVY1プラスミドに挿入されています。プラスミドｐＶＹ１は、プラスミドｐＲＳＶ１０（ファインケミカルズ社製）のＢａｍＨ１－Ｋｐｎ１断片（約２９００塩基対）と、プラスミドｐＡｄＤ２６ＳＶ（Ａ）Ｎ３（Ｎ）（博博士より入手）のＥｃｏＲ１消化断片とを連結することにより調製した。東京大学半田教授（両平滑末端受容後）改良されたＡＰＴ遺伝子および本発明の遺伝子の下流に位置するイントロンおよびポリアデニル化配列は、別の適切な発現ベクターに挿入され、形質転換体を得るためにさらに適切な宿主細胞に導入され得る。 .coliを宿主細胞として使用することができる。枯草菌等の真核微生物、酵母等の真核微生物、高等動物の細胞等が挙げられる。大腸菌の代表としては、通常、Ｋ１２株に属するＪＭ１０９株、Ｗ３１１０株、Ｑ等が用いられ、枯草菌の代表としては、ＢＤ１７０株、ＢＲ１５１株等が用いられる。酵母としては、RH218株、SHY1株などが使用できます。酵母サッカロミセス・セレビシエ。発現には、宿主細胞と適合する種に由来するレプリコンおよび調節配列を含むプラスミドベクターまたはファージベクターが通常使用されます。大腸菌用のベクターの例は、例えば、プラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９など、ファージ、例えば、ｑｔ、Ｃｈａｒｏｎ４Ａなど、ファージＭ１３などである。ｐＵＢ１１０は、枯草菌用のベクターとして使用することができる。酵母用ベクターとしては、ｐＳＡ２１００等、ＹＲｐ７、ＹＥｐ６１等を用いることができる。ベクターには、目的のタンパク質を発現できるプロモーターが組み込まれている必要があります。大腸菌遺伝子やファージ遺伝子のプロモーターとしては、例えば、Lae、trp、tac、trc、pL等を用いることができる。宿主としては、アカゲザル腎細胞、蚊幼虫細胞、アフリカミドリザル腎細胞、マウス胎児線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ヒト胎児腎細胞、蝶卵組織細胞、ヒト子宮頸部上皮様細胞等の培養動物細胞が挙げられる。細胞、ヒト骨髄腫細胞、マウス線維芽細胞などが使用できます。ベクターとして、SV40 初期プロモーター、SV40 後期プロモーター、真核生物遺伝子 (エストロゲン誘導性トリオボアルブミン遺伝子、インターフェロン遺伝子、グルココルチコイド誘導性チロシンアミノトランスフェラーゼ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、初期プロモーターなど) のプロモーターを搭載した SV40 を使用できます。後期アデノウイルス遺伝子、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子、因子遺伝子など）、ウシパピローマウイルスまたはそれらに由来するベクター。また、細胞によって分泌・生産されるAPTは、切断部位の違いによりN末端が異なることが知られています。培養細胞を宿主としてAPTを分泌・生産する場合、細胞の種類に応じてシグナルペプチダーゼやプロテアーゼの切断方法が異なるため、N末端の異なるAPT種が得られる。この現象は、培養細胞を用いて分泌・生産する場合に限らず、大腸菌、枯草菌、酵母などの特殊な改変を施した細胞を介してAPTを取得する場合にも同様の現象が起こり得ると考えられる。改良型APT遺伝子を組み込んだ発現ベクターを用いた宿主の形質転換には、大腸菌の場合、hanahan, Hanahan, D.J.Molの方法を用いることができる。 Biol.、166、557、1983）、動物細胞の操作の場合、リン酸カルシウム法を使用できます（Vander Eb、A.J.およびGraham、F.L.、Method in Enrymoloqy、65、826、1980、Academic Press）。すぐ。上述のように、改良された APT は、血管凝固（さらには深部静脈）、肺塞栓症、末梢動脈血栓症、心臓または末梢動脈の損傷による塞栓症、急性心筋梗塞および血栓性発作。天然に存在するヒト APT と同様に、改良された APT は急性心筋梗塞の治療に特に適しています。天然に存在するヒト APT は、30 ～ 70 mg の用量を 1 ～ 3 時間かけて静脈内投与すると、冠状動脈閉塞血栓の溶解、心筋灌流の再生、および虚血心筋層の大部分の回復に効果があることが最近示されました。改良されたAPTは血中での生物学的半減期が延長されているため、天然に存在するヒトAPTと同じ場合に効果的です。改善されたAPTは、単回投与した場合でも、天然に存在するヒトAPTで推奨される用量の約10％の用量で、天然に存在するヒトAPTと同様の臨床効果を生み出す可能性があると予想される。さらに、本発明の改良型APTは、天然ヒトAPTおよび改変型APTではこれまで知られていなかった以下の貴重な特性を示す。 a) 抗炎症作用。血栓の部位では、血栓自体の形成だけでなく、フィブリン分解産物または微量のキニンの形成も検出されます。これらの物質は炎症誘発活性があることが知られており、したがって血栓の領域に炎症を引き起こします。この理由から、血栓症の治療に使用される薬剤は、血栓溶解活性だけでなく、抗炎症活性も有することが望ましい。研究の結果、出願人は改良型APTに2つの機能に基づいて抗炎症活性を付与することができた。その 1 つは、改良された APT が、炎症反応のメディエーターの 1 つであるインターロイキン 1 (IL-1) の生物学的活性を阻害することです。マクロファージによって産生されるIL-1は、高体温、線維芽細胞の増殖促進、滑膜細胞膜におけるコラゲナーゼの産生などを介して、あるいは血管内皮細胞におけるプロスタサイクリン合成を促進することによって、炎症反応に関与すると考えられています。また、IL-1は肝細胞に作用し、タンパク質（血清アミロイドタンパク質、フィブリノーゲンなど）の生成を促進することが知られています。）急性期では炎症とともに増加します。出願人は、改良されたＡＰＴが、ＩＬ－１の生物活性の一つであるマウス胸腺細胞の分裂促進反応性を高める活性（ＬＡＦ活性）を阻害することを見出した。もう一つの機能は、アドバンストAPTは血栓部位の炎症により生じる変性タンパク質（変性免疫グロブリンG、変性アルブミンなど）に対して親和性を有し、さらにこの変性タンパク質によって活性化される性質を有していることである。この活性により、改良型APTは炎症部位の変性タンパク質のみを分解し、炎症を一時的に軽減することができます。出願人は、改良型APTが変性タンパク質のみを分解することをドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動により確認した。図１に示すように、図２６から、変性タンパク質による改良されたＡＰＴの活性化および選択性が明らかである。ＨＣｌで処理した免疫グロブリンＧおよび数倍低い濃度では、ＢｒＣＮで処理したフィブリノーゲンと同じ活性が示された。一方、正常な免疫グロブリンCは、500μg/mlの濃度でもAPT改善に対する活性化効果を示さない。閉塞部位の灌流回復後の再閉塞の防止血管。天然APTで血栓症を治療すると、閉塞した血管の血流が回復した後に高頻度で再閉塞が観察されることが知られています。このため、血小板凝固阻害剤や抗凝固剤との併用療法が行われます。しかし、併用療法には薬物相互作用、用量制御、同様の効果などの問題が伴います。好ましくは、ＡＰＴ自体がさらに再閉塞防止活性を有する。本発明の改良されたＡＰＴは、２つのタイプの活動を通じて再閉塞事象を防止する能力を有する。 1つ目は、改良型APT導入後の作用持続時間の延長によるAPT濃度の急激な低下を防止し、スチュワート・ホームズ徴候の消失をもたらし、再閉塞の発生を防止するものである。 2 番目のタイプは、血管内皮細胞に対する IL-1 誘発性損傷を防止することにより、血小板凝固が間接的に阻害され、それによって再閉塞現象が防止されるものです。 c) 安定性の向上。タンパク質製剤は通常不安定であるため、凍結乾燥状態または溶液の状態で低温で保存することをお勧めします。急性心筋梗塞患者にプラスミノーゲン活性化因子を投与する場合、死亡率を下げるために発作発症後数時間以内に投与する必要がある。この場合、室温で保存できる安定な製剤が望ましい。また、安定性が高まるため、熱処理や酸処理等も可能となります。薬の準備中に。特に、細胞培養により産生される本発明の改良ＡＰＴについては、熱に弱いことが知られている細胞由来のレトロウイルスを除去することが可能となる。以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。他に指定がない限り、組換え DNA は実験室のガイドラインに従って生成されます。 Maniatis T et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、コールドスプリングハーバーラボラトリーズ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク (1982)。例 1. DNA APT へのクローニング。 Bowes ヒト黒色腫細胞 (R. Roblin 博士から購入) 米国国立癌研究所の）をＯｐｄｅｎａｋｋｅｒらの方法に従って培養する。 (Opdenakker, G.ら、Eur. J. Biochem、131、481-487 (1983))。 APT mRNAを誘導するために、培養液にTPA（12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート）を最終濃度100ng/mlとなるように添加し、16時間培養した。次に、Freeman et al.の修正方法に従って、培養細胞から全細胞RNAを抽出しました。 ((岡山)Berqa DNA マニュアル、3 ページ、1985 年、薬局ファインケミカルズ)。オリゴdTセルロースカラム(ファルマシアファインケミカル社製)を用いて、細胞の全RNAからポリ(A) + RNAを分離します。その結果、約10 個の細胞から約400μgのポリ(A) + RNAが得られる。このポリ(A) + RNAは、常法によりショ糖密度勾配遠心分離により分画される。分画されたポリ(A) + RNA の一部が選択され、APT mRNA に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用してドットブロットハイブリダイゼーションが実行されます (Perbal, B.、Apractical Gube to Molecular Cloninq、410、1984、John Wiley and Sons, Inc)。。ここで使用したプローブ（プローブＹ）は、Ｐｅｎｎｉｃａｅｔａｌが記載したＡＰＴ配列のアミノ酸残基＋２９１〜＋２９７をコードするｍＲＮＡの領域に相補的な塩基配列５”−ＧＣＮＮＧＧＣＡＡＡＧＡＴＧＧＣＡ−３”を有し、以下により合成される。ＤＮＡ合成機モデル３８０Ａ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いたβ−シアノホスファミデート法。 DNAオリゴマーの合成、脱保護、樹脂切断、精製はDNA合成機Model 380Aの取扱説明書に従って行う。タグ付け放射性同位体５”末端のＹプローブは、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造株式会社製）と−（３２Ｐ）ＡＴＰを用いて実験室マニュアルに従って行われる。Ｙプローブは、主に、 20-30S ポリ (A) + RNA (この画分を画分 M と呼びます) テンプレートを使用して、画分 M から 10 μg のポリ (A) + RNA を取得します。逆転写酵素を使用して 3 μg の二本鎖 cDNA を合成します。生化学工業株式会社製）を用いて、ギュブラー・ホフマン法（Gubler, U. and Hoffman, B.J., Gene 25, 263, 1983）に従って、二本鎖cDNAの末端位置にデオキシC鎖を付加する。３”末端は、Ｄｅｎｑ−Ｗｕ法（Ｄｅｎｑ，Ｇ．Ｒ．およびＷｕ，Ｒ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、９、４１７３、１９８１）に従って形成される。デオキシＣ鎖が伸長された二本鎖ｃＤＮＡをセファロースＣＬ４Ｂ（ファインケミカル社製）上でゲルろ過し、５００塩基対未満の低分子核酸を除去する。次に、cDNA を、P st 1 部位にデオキシ G 鎖を含む pBR322 (Bethesda Research 製) とアニーリングします。伝統的な手法。アニーリング後に得られた混合物を大腸菌HB101コンピテントセル（宝酒造社製）に形質転換した。その結果、約 4000 個の独立した形質転換体からなる cDNA バンクが得られます。このｃＤＮＡを、Ｗｏｏｄｓの方法（Ｗｏｏｄｓ，Ｄ．、Ｆｏｃｕｓ、６（３）、１、１９８４、ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂ．）に従って、上記のＹプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行い、Ｙプローブと反応するクローンを取得する。クローンの中で、最も長い APT cDNA を含む pTPA1 クローンが同定されます。次いで、Ｍ１３ファージベクターおよび７－ＤＥＡＺＡ法（ＭｉｚｕｓａｗａＳ．ら、ＮｕｃｌｅｉｓＡｃｉｄｓ）を使用して、ジデオキシ法が実行される（Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｑｙ、１、２５３、１９８４）。 Res.、14、1319、1986）。その結果、プラスミドｐＴＰＡ１には、Ｐｅｎｎｉｃａｅｔａｌにより記載されたＡＰＴ遺伝子のＴｙ＋４４１からＡｙ＋２５４４までの塩基配列が含まれることが判明した。例 2. 改良された APT (II) の設計。実施例１に示すプラスミドｐＴＰＡ１では、Ｎ末端領域が改良型ＡＰＴ（ＩＩ）を構築するには不十分であり、クリングル１ドメインが欠如している。そこで、３８０ＡＤＮＡ合成機（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、上記のように欠損ＤＮＡセグメントを合成する。合成したオリゴマーの塩基配列と完全合成配列を図１に示す。 1-4. これらのオリゴマーを使用して改良されたＡＰＴ（ＩＩ）を構築するための具体的な技術を図１に示す。 5-6. 2-1)。ブロックIVの構築(Bql II-Eco R1フラグメント、約480塩基対)。図のブロック IV の断片。図５は次のようにして得られる。まず、ラボマニュアルに従って、図１に示す合成オリゴヌクレオチド２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５をそれぞれ４０ｐｍｏｌずつ添加した。１〜２をそれぞれ５０μｌの反応液中で１０ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）を用いて３７℃、１時間リン酸化した。反応溶液をフェノールで処理する。エタノールで沈殿させた後、沈殿物を減圧乾燥し、滅菌蒸留水に溶解する。各オリゴマー 40 pmol を 6 mM Tris-HCl (pH 7.5)、20 mM NaCl、7 mM MgCl 2 および 0.1 mM EDTA を含む溶液 150 μl に 80℃ の温度で 5 分間静置した後、ブロック I (オリゴマー 1、2、3、および 4)、ブロック II (オリゴマー 5、6、7、8、9、および 10)、およびブロックの対応するブロックにおいて、60℃で 5 分間、室温で 1 時間III（オリゴマー１１、１２、１３、１４、１５および１６）は、エタノール沈殿および減圧下での乾燥を行う。残渣を40μlの滅菌蒸留水に溶解する。反応は、DNA ligation kit(宝酒造社製)を用いて、反応液400μl中で4℃、15時間行った。エタノールで沈殿させ、減圧下で乾燥させた後、沈殿を滅菌蒸留水に溶解します。ブロック I (1) の場合、ゲル電気泳動は 5% ポリアクリルアミド中で実行され (実験室マニュアル)、伝統的な方法で分離および精製されます。（ラボマニュアル）、約100塩基対の断片、ブロックII（2）とブロックIII（3）の場合、3％アガロースゲル（LMPアガロース、BRL社製）でゲル電気泳動を行う（ラボマニュアル） ) および約 190 ペアのフラグメントが電気溶出によって分離および精製されます (実験室マニュアル)。次いで、上記のDNAライゲーションキットを使用して、それぞれ0.1μg、0.2μg、および0.2μgのブロックI、ブロックII、およびブロックIII断片をライゲーションした。サイズ約４８０塩基対のＢｇｌＩＩ－ＥｃｏＲ１フラグメント（ブロックＩＶ）を単離するために、ゲル電気泳動を１．５％のアガロース濃度で実施する。次に、電気溶出を使用して DNA をアガロースゲルから単離します。次いで、このＤＮＡを、１０ユニットの上記Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、１００μｌの反応溶液中で３７℃で１時間リン酸化し、次いでフェノールで処理し、エタノールで沈殿させ、減圧下で乾燥させる。この合成遺伝子断片とブロックIVの塩基配列は、M13ファージベクターを用いたジデオキシ法により塩基配列を決定することにより確認される。具体的な技術を図２に示す。６．上記ブロックIVのBgl II-Eco R1断片と、制限酵素BamH1（ベーリンガーマンハイム山ノ内社製）で消化したM13 mp18 DNA（ベーリンガーマンハイム山ノ内社製）とをライゲーションした後、）およびEco R1（ベーリンガーマンハイム山内株式会社製）の塩基配列は、M13シークエンシングキット（多良花酒造株式会社製）および7-DEAZAシーケンシングキット（タカラ株式会社製）を用いて決定される。酒造株式会社）。 Bgl11 制限酵素切断部位と BamH1 制限酵素切断部位は、(BamH1 - Bgl11 切断末端 - 切断部位) を介してアイソシメラ配列で連結され、連結された断片は Xho 11 制限酵素によって切断され、天然の Bgl が得られます。 11 および Bamh1 切断はそれぞれ終了します。塩基配列をより正確に決定するために、Messing/Messing J.法、Methods in Enzymology、101、20-78 (1983)に従って、E.cjli JM109株にファージM 13mp18（ブロックIVの断片を含む）を感染させる。））その後、二本鎖DNAが得られます（複製型）。このＤＮＡ（５０μｇ）を制限酵素Ｘｈｏ１１（ベーリンガーマンハイム山内社製）およびＥｃｏＲ１で消化後、１．５％アガロースゲルでゲル電気泳動を行い、約４８０塩基の断片（ブロックＩＶ）を単離した。ペア。この DNA は電気溶出によって抽出されます。抽出したDNAとEco R1およびBamH1制限酵素で消化したM13mp19 DNA（ベーリンガーマンハイム山内社製）を上記と同様にライゲーションした後、DNAライゲーションキットを用いて塩基配列を決定した。上述したように、この配列は、M13mP18 および M13mp19 を使用して両方の DNA を配列決定することにより、より正確に検証できます。さらに、M13mp19 二本鎖複製 DNA (ブロック IV 付き) を記載の方法で調製しました。この DNA (50 μg) を制限酵素 Eco R1 および Xho 11 で消化した後、1.5% アガロース中でゲル電気泳動を行い、サイズ約 480 塩基対のフラグメント (ブロック IV) を単離します。 2-2)。ブロック V (Eco R1-Bal1 フラグメント、約 1250 塩基対) の単離。実施例１で得られたｐＴＲＡ１クローンから、実験室マニュアルに記載の方法に従って、図１に示すようにプラスミドＤＮＡを大量に単離した。５．このＤＮＡ７０μｇを制限酵素Ｂａｌ１（宝酒造社製）とＮａｒ１（ニロゲン社製）で消化した後、０．８％アガロースゲルで電気泳動を行い、 Nar1-Bal1 フラグメント (約 1540 塩基対) を単離します。 DNA は電気溶出によって分離されます。この DNA を制限酵素 Eco R1 でさらに部分消化した後、0.7% アガロースゲルで電気泳動を行い、Eco R1-Bal1 フラグメント (約 1250 塩基対) を単離します。 DNA は電気溶出によって分離されます。 2-3)。ブロックIVおよびブロックVからの改良型APT遺伝子(II)の構築。図５に示すように、改良されたＡＰＴ遺伝子は次のようにして得られる。上記ＤＮＡドーピング用キットを用いて、実施例２－１で得られたブロックＩＶ（断片Ｂｇｌ１１－ＥｃｏＲ１、約４８０ｂｐ）に実施例２－２で得られたブロックＶ（断片ＥｃｏＲ１－Ｂａｌ１、約１２５０ｂｐ）をドーピングした後、ドープされた生成物はエタノール沈殿に供される。沈殿を減圧乾燥後、常法により制限酵素Xho11で消化する。次いで、Bgl 11-Xho 11フラグメント(約1500塩基対、改善されたAPTの遺伝子を含む)を単離するために、0.8%アガロースゲルで電気泳動を実行する。次に、DNA は電気溶出によって単離されます。このようにして得られた改良型ＡＰＴ遺伝子（ＩＩ）の全塩基配列を図１に示す。 8-13。推定アミノ酸配列も図１に示す。 14-19。実施例３．改良されたＡＰＴＶ、ＶＩおよびＶＩＩＩの遺伝子の構築。改良型ＡＰＴ遺伝子Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩＩの構築は、改良型ＡＰＴ遺伝子（ＩＩ）に基づいて、以下の文献を参考にして行う。遺伝子変換は、部位特異的な突然変異を誘発することによって行われます。出版物: Zoller M. J. and Smith M.、Method in Fermentology、100、468-500 ページ (1983)、Zoller M. J. and Smith. M. DNA, 3, pp. 479-488 (1984)、Morinaga Y. et al. Biotechnology, pp. 636-630 (1984 年 7 月)、Adelman J.P. et al.、DNA, 2, pp. 183-193 (1983) ）、６．株式会社ジーンサイエンスルーム発行のＭ１３シークエンシングマニュアル（ｐｕＣ））。 3-1)。改良型APT遺伝子の構築(V)。 A) 突然変異のための M13mp19 (APT/P/) の作成。実施例２の２−３）に詳細に記載した改良ＡＰＴ遺伝子断片（II）を、BamH1制限酵素とアルカリフォスファターゼで処理したM13mp9二本鎖DNA（宝酒造社製）に連結した。ライゲーション産物をE.cjli JM109コンピテントセル（宝酒造社製）にトランスフェクションした。無色の無菌スポットを生成する各クローンを使用して大腸菌 JM109 を感染させます。一本鎖 DNA は培養上清から単離され、二本鎖 (複製) DNA はメッシング法 (J. Messing, Methods in Enzymology, 101, pp. 20-78, 1983) に従って E. cli 細胞から単離されます。）。この二本鎖DNAの性質を解析し、アガロースゲル電気泳動により制限酵素Pst1で消化後、mp9 DNAにAPT(II)遺伝子が挿入されたクローンmp9(改良型APT(II))が得られます。制限酵素 Pst によるこれらの DNA の一部の切断後、0.8% アガロースゲルでの電気泳動が行われます。クローン mp9 (改良型 APT (II)) は 7300 位に単純なバンドを示します。このクローンの一本鎖 DNA は、部位特異的変異を誘導するために次の実験で使用されます。 B) 部位特異的変異を誘導できるプライマーの合成。改良型APT(II)遺伝子に部位特異的変異を導入するための合成オリゴヌクレオチドは、Model 380A DNA合成機(Applied Biosystems社製)を用いてα-シアノエチルホスホアミデート法により合成した。 DNA オリゴマーの合成、保護基の除去、樹脂からの切断、精製は DNA 合成装置 380A の取扱説明書に従って行います。特定の部位に変異を誘導するには、部位特異的突然変異を誘導するプライマー（２）は、Ｍ１３ファージベクターを使用するジデオキシ配列決定のために得られる（Ｊ．Ｃａｒｌｓｏｎら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１、２５３頁、１９８４）。改良型 APT (II) のアミノ酸配列とヌクレオチド配列を示します。突然変異を誘導することができるプライマー (1) は、下線を引いた塩基が改良型 APT (II) の遺伝子配列とは異なります (表 1 を参照)。 C) 部位特異的変異の誘導。以下に、変異を生じさせることができるプライマー（１）の塩基配列を含むクローン、すなわち改良型ＡＰＴ遺伝子（IV）を作製する方法を示す。実施例 3.3-1)、A) クローン mp9 (改良型 APT (II) およびプライマー (1) に記載の一本鎖 DNA のアニーリング (再生) 後、再生産物は二本鎖 DNA に変換され、次に、次に、配列決定プライマーを使用してDNA配列をスクリーニングし、変異した改良型APT遺伝子(II)を有するファージクローン、すなわち改良型APT遺伝子(V)を単離する。このクローンから改良型APT遺伝子(V)を単離する。合成オリゴマーの5''末端をリン酸化する。部位特異的変異を誘導するプライマーDNA(1)を実施例2.2-1に記載の方法でリン酸化する。ヘテロ二本鎖 DHE。制限酵素 BamH1 で消化した 0.5 μg の一本鎖 DNA M13mp9 (改良型 APT (II))) および 1.5 μg の二本鎖 DNA M13mp9 を、2 pmol のリン酸化プライマーを含む 30 μg の溶液中で加熱します。 (1) 10 mM Tris-HCl (pH 7.5)、0.1 mM EDTA および 50 mM NaCl、90 ℃ (2 分)、50 ℃ (5 分)、37 ℃ (5 分) および室温 ( 10分）。 4単位のKlenow酵素、7単位のT4ファージDNAリガーゼ、0.1mM EDTA、12mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、0.7mM ATP、 0.07 dATP、およびプライマー伸長を刺激するための dGTP、dTTP、および dCTP それぞれ 0.2 mM。混合物を２０℃の温度で２時間、４℃の温度で１５時間反応させる。上記溶液と大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造社製）を用いて、溶解スポットが形成されるまで形質転換を行う。無色のスポットを分離した後、ファージを大腸菌JN109に感染させて増殖させます。次に、各クローンの培養上清から鋳型一本鎖 DNA を取得します。これらの一本鎖DNAを、シーケンシングプライマー(2)を用いたジデオキシ法の「T」反応(実施例3-2の反応「A」および「T」)のみを行い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行う。乾燥後、ゲルをオートラジオグラフィーで分析します。その結果に基づいて、所望の変異配列を有するクローンが同定される。クローンの培養上清を使用して大腸菌 JM109 細胞を感染させ、プレートに再接種して単一スポットを分離します。得られた単一スポットから、上記の方法に従って一本鎖DNAを単離する。これらのDNAを用いて、まずシーケンシングプライマー(2)を用いたジデオキシ法によりDNA塩基配列を決定し、目的の塩基配列に変異したクローンを取得する。このファージクローンを実施例２に記載のメッシング法を用いて大腸菌ＪＭ－１０９に感染させた後、二本鎖ＤＮＡが得られる。この二本鎖ＤＮＡを制限酵素Ｘｈｏ１１で消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動を行い、改良型ＡＰＴ遺伝子を含む約１５００塩基対の断片（改良型ＡＰＴ遺伝子（Ｖ））を単離する。さらに、ジデオキシ法を用いて得られたＤＮＡの全塩基配列を決定することにより、当該ＤＮＡが改良型ＡＰＴ（Ｖ）遺伝子であることが判明した。Ｖ）遺伝子（ただし、シグナルペプチド－３５～－１を含む）を図１１～１３に示す。また、これに由来するアミノ酸配列を図１７～１９に示す。３－２）改良型遺伝子の構築。 APT (VI) および (VIII)。この技術は、実施例３、３−１）で説明したものと同様である。まず、M13mp3（改良型APT(II)）を構築し、部位特異的変異を導入するためのプライマーを合成します。これらのプライマーの塩基配列は上記の通りであるが、改良型ＡＰＴ遺伝子（ＶＩ）および改良型ＡＰＴ遺伝子（ＶＩＩＩ）を構築するために、５”末端リン酸化プライマー（３）および５”末端リン酸化プライマー（５）を作製する。 ) がそれぞれ使用されます (参照テーブル 2)。部位特異的変異を導入した後、ジデオキシ法により完全な塩基配列を決定します。所望の塩基配列を有することが確認された。このようにして、改良型ＡＰＴ（ＶＩ）および改良型ＡＰＴ（ＶＩＩＩ）の遺伝子が得られる。次いで、これらの遺伝子を実施例４および５に記載の手順に従ってｐＶＹ１ベクターに組み込む。実施例４．改良型ＡＰＴ遺伝子（ＩＩ）のｐＶＹ１ベクターへの組み込み。 4-1) pVY1ベクターの構築。 pVY1ベクターは図１に示すように作製される。 7. A) pAdD26SV (A) N3 (N) の構築および Eco R1 切断部位の平滑末端化。まず、DNA pAdD26SV(A) N3 (Mo1, Ce 11. Biol, 2 (11, (1982)) の抄録から知られる、東京大学の半田博博士から購入) を制限酵素 Bgl11 (製造) で消化します。次いで、ＤＮＡを常法によりクレノウ酵素（ベーリンガーマンハイム山ノ内社製）を用いて平滑末端化し、フェノール処理後、エタノール沈殿を行う。沈殿を滅菌蒸留水に溶解し、この反応液でテトラサイクリン耐性を示す形質転換体からプラスミドＤＮＡを得る。通常の方法で、これらの DNA の一部を制限酵素 BgL 1 で消化した後、0.7% アガロースで電気泳動を行います。その結果、制限酵素 BgL 11 で消化されない DNA が得られます。 (A) N3 (N)) このクローンの DNA を従来の方法で制限酵素 Eco R1 で切断し、上記のように Klenow 酵素を使用して DNA を平滑化します。フェノールで処理し、エタノールで沈殿させ、減圧下で乾燥させた後、沈殿を滅菌蒸留水に溶解する。 B) pKSV10からのKpn 1-BamH1フラグメント(約2900 bp)の単離および平滑末端の形成。 pKSV10 DNA（ファインケミカル社製）を常法により制限酵素Kpn1とBamH1で消化した後、T4 DNAポリメラーゼを用いてDNAの平滑末端化を行う（ラボマニュアル、114～121ページ）。次に、0.7% アガロースゲルで電気泳動を実行し、サイズ約 2900 塩基対のフラグメントを単離します。次に、断片を電気溶出して DNA を抽出します。

C) pVY1の構築。Ａ）で得られたＤＮＡ断片とＢ）で得られたＤＮＡ断片とをライゲーションした後、コンピテント大腸菌ＨＢ１０１細胞（上記）の形質転換を行う。伝統的な方法を使用して、テトラサイクリン耐性を示す形質転換体からプラスミド DNA を取得します。これらのプラスミドＤＮＡの一部を制限酵素Ｐｓｔ１（ベーリンガーマンハイム山内社製）で消化した後、１．０％アガロースゲルで電気泳動を行った。結果として、約3400塩基対、約3200塩基対、および約1400塩基対のバンドを特徴とするクローン(プラスミドpVY1)が得られる。この大腸菌クローンＨＢ１０１（ｐＶＹ１は、登録番号Ｐ－９６２５（ＦＥＰＭＢＰ２１０６）として工業技術院発酵技術総合研究所に寄託されている。４－２）改良型ＡＰＴ遺伝子（II）の組み込み) を pVY1 ベクターに挿入します。実施例４−１）で得られたプラスミドｐＶＹ１のＤＮＡを常法により制限酵素ＢｇＬ１１で消化した後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）を用いて脱リン酸化を行った。次に、フェノールによる処理を３回行う。そして、エタノールで沈殿させ、減圧乾燥した後、沈殿物を滅菌蒸留水に溶解する。このＤＮＡと実施例３、３−１）で得たＢｇＬ断片１１−Ｘｈｏ１１（約１５００塩基対）をライゲーションした後、上記の方法に従ってライゲーション産物でＨＢ１０１コンピテント大腸菌細胞を形質転換した。プラスミド DNA は、テトラサイクリン耐性形質転換体から伝統的な方法で調製されます。これらのDNAを制限酵素(BqL11、Pst1)で消化した後、pVY1ベクターの改良型APT遺伝子(II)を必要な方向に組み込んだクローンを選択し、解析により選択を行う。アガロースゲル電気泳動パターン。まず、これらのDNAの一部を制限酵素BqL 11で消化し、0.8%アガロースゲルで電気泳動し、BqL 11-Xho 11断片がBqLに連結したときの約1500 bpの断片バンドを有するクローンを得る。フラグメント 11 プラスミド pVY1、Xho 11 と BqL 11 の連結部分は、制限酵素 BqL 11 で切断できます。これらのクローンのプラスミド DNA の一部をさらに制限酵素 Pst1 で消化し、電気泳動に供します。０．８％アガロースゲル中で、約３４００ｂｐの単一バンド、約２３００ｂｐの２つのバンド、約１４００ｂｐの１つのバンド、および約８０ｂｐの１つのバンドを有するクローンを得る。このクローン（実験室マニュアルに従ってプラスミドｐＶＹ１－ＡＰＴ（ＩＩ）を使用し、プラスミドＤＮＡを取得する。実施例５．ベクターｐＶＹ１への改良型ＡＰＴ（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩＩ）の遺伝子の組み込み。切断後）実施例４－１）で得られたプラスミドｐＶＹ１のＤＮＡをアルカリホスファターゼ（宝酒造社製）を用いて常法により制限酵素ＢｑＬ１１脱リン酸化し、次いで、制限酵素ＢｑＬ１１で処理（３回）した。フェノールで洗浄し、エタノールで沈殿させ、減圧下で乾燥させます。次いで、沈殿物を滅菌蒸留水に溶解する。このＤＮＡを実施例２、２〜３）で得た約１５００塩基対のＢｑＬＩＩ−Ｘｈｏ１１断片とライゲーションした後、ライゲーション産物を上記のコンピテントＨＢ１０１大腸菌細胞に形質転換する。テトラサイクリン耐性を示す形質転換体から常法に従ってプラスミドDNAを調製する。これらの DNA を制限酵素 BqL11 および PstI で消化した後、アガロースゲル電気泳動を行います。アガロースゲルでの分離パターンを解析することにより、改良型APT(V)遺伝子がpVYIベクターに目的の方向に挿入されたクローンが選択されます。まず、これらのDNAの一部を制限酵素BqL11で消化した後、0.8%アガロースゲルで電気泳動を行ってクローンを取得すると、約1500塩基対のバンドが得られる。 BqL11-Xholl断片をpVYIベクターのBqL11断片に連結すると、上述のアイソシゾマー構造により、BqL11制限酵素によりXhollとBqL11部分が切断され得る。これらのクローンの血漿ＤＮＡの一部を制限酵素ＰｓｔＩでさらに消化した後、０．８％のアガロースゲル濃度で電気泳動を行い、約３４００ｂｐのバンド、約２３００ｂｐのバンドを与えるクローンを得る。約 1400 bp の 2 つのバンド、約 800 bp の 1 つのバンド、および約 80 bp の 1 つのバンド。クローン（プラスミドｐＶＹＩ－ＡＰＴ（Ｖ））を用いて、ラボマニュアルに基づいてプラスミドＤＮＡを大量に取得する。同様に、改良型 APT (VI) および (VIII) の遺伝子が pVYI ベクターに組み込まれています。実施例６ＣＨＯ細胞における高度なＡＰＴの発現。プラスミド pVYI - 改良型 APT (VI)、APT (II)、APT (V) または APT (VIII) を DHFR 欠損 CHO 細胞にトランスフェクトします (Urlaub, et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 77) （７）、４２１６−４２２４、１９８０）リン酸カルシウム法による（Ｇｒａｈａｍ，ｅｔａｌ．、Viroloqy、52、456、1973）。メトトレキサート（MTX）存在下、選択培地（MEM A LPHA（-）、GIBCO）上で得られた形質転換体クローンは、50～100単位/mlのAPT活性を示すことが判明した（記載のフィブリン／アガロースプレート法により測定した値）。下に）。このクローンはその後の研究に使用されます。生産培地としては、２０インターナショナルユニット／ｍｌ（ＳＩＧＭＡ）のアプロチニンを添加したＧＩＴ培地（フアコ純薬工業株式会社製）を使用した。実施例７．ＣＨＯ細胞の培養上清からの改良型ＡＰＴの精製。実施例６で得られた培養上清を抗ＡＰＴモノクローナル抗体アフィニティーカラムを用いて部分精製した。モノクローナル抗体を産生するハイブリッドは、従来の方法でヒト黒色腫細胞に由来するAPTに対して調製されます。抗体産生ハイブリッドをマウスに接種し、腹水中に発生したモノクローナル抗体（サブクラス：IgGM1）をセルロフィンプロテインA（生化学工業社製）と同社製MAPSモノクローナル抗体精製緩衝液システムを用いて抽出・精製する。ビオラッド研究所による。抗体は、従来の方法により、ゲル１ｍｌ当たり４ｍｇの割合でＣＮ３ｒ活性化セファロース（ファルマシアファインケミカルズ社製）に結合される。抗体ゲル (24 ml) を 4 リットルの培養上清と混合します。４℃で一晩穏やかに振盪した後、ゲルをカラム（直径１．５ｃｍ×２０ｃｍ）にロードする。次に、ゲルを各 125 ml で連続的に洗浄します。次の解決策（１）２５インターナショナルユニット／ｍｌアプロチニン（シグマ社製）および０．０１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含むトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．４（緩衝液Ａ）、（２）０．５ＭＮａＣｌを含む緩衝液Ａ、（３）緩衝液4 M 尿素を含む A、および (4) バッファー A。改良されたゲルに結合した APT を、25 インターナショナルユニット/ml アプロチニンおよび 0.01% (w/v) Tween 80 を含む 0.2 M グリシン-HCl pH 2.5 バッファーで溶出しました。縮小されて結合されます。 25 国際単位/ml アプロチニンおよび 0.01% (w/v) Tween 80 を含む 10 mM トリス塩酸緩衝液、pH 7.4 に対して一晩透析した後、透析液を真空遠心濃縮装置 (Speed VAC、製造元) で 20 ～ 30 倍に濃縮します。 SAVANT Inc.による）。濃縮物を、0.15 M NaCl、25国際単位/mlのアプロチニンおよび0.01% (wt/vol) Tween 80を含む10 mM Tris-HCl緩衝液、pH 7.4に対して一晩再度透析し、その後のin vitroおよびin vivo評価に使用します。。最終的に、比活性は 3700 ～ 5000 倍に増加し、収率は APT の活性の 36 ～ 42% になります (フィブリン/アガロースプレート法によって測定)。この活性画分をドデシル硫酸ナトリウム電気泳動と銀染色により分析します。還元条件下では、他のいくつかのバンドとともに、54 キロダルトンで非常に強いバンドが観察されます。次いで、電気泳動ゲルを２．５％（ｗ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ－１００で処理し、フィブリン／アガロースプレート上に置き、３７℃でフィブリンをサインし、それによって溶解したバンドが約５０キロダルトンで検出される。同じプレートでは、天然の APT が約 60 キロダルトンに現れます。結果は、抗体アフィニティーカラムに吸着され、この方法によって溶出されたAPTが、天然型の分子量より約10,000小さい分子量を有する改良型APTに相当することを示している。実施例８．改良されたＡＰＴの比活性の測定。部分的に精製された高度なＡＰＴ中のタンパク質の量は、参照タンパク質としてウシ血清アルブミンを使用し、ブラッドフォード法（ブラッドフォード、アナル、ボケム、７２、２４８（１９７６））に従って総タンパク質を測定することによって決定される。 APT抗原の量は酵素免疫測定法（ELISA）によって測定されます。線維素溶解活性は、フィブリン／アガロースプレート法および 125 Ｉ標識フィブリンフィルム溶解法により測定した。フィブリン/アガロースプレートは、95%凝固フィブリノーゲンに寒天を加えることによって調製されます。１標識フィブリンフィルム１２５を溶解する方法は、Ｈｏｙｒａｅｅｒｔｓらによって記載されているように実行される。（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７、２９１２、１９８２）、ＢｉｏｓｃｏｔｔＩｎｃ．によって製造されたヒト黒色腫細胞からの標準ＡＰＴとして使用される。 APT の国際標準に従って標準化されています (Gaffuey および Curtis、Thromb. Haemostas、53、34、1985)。 125 Ｉ－フィブリン膜溶解法により測定した活性値と酵素免疫吸着法（ELISA）により測定した抗原量から計算した比活性値は、300,000～420,000単位/抗原mgの範囲であった。実施例９．フィブリンに対する改善されたＡＰＴの親和性およびフィブリンによる活性化

Verheijen, et al./EMBOJ, 5, 3525, 1986)の研究に従って、改良されたAPTのフィブリンに対する親和性が研究された。改良型または天然型APT（1000単位/ml）を様々な濃度でフィブリノーゲンに添加し、続いて1単位のトロンボーンを添加し、室温で3分間反応させます。得られたフィブリン塊を、16,000 rpmで8分間遠心分離することによって沈殿させ、フィブリンに結合していないAPTの量を、フィブリン/アガロースプレート法の活性を測定することによって決定する。その結果、改良型APT(VI)は天然型と同様のフィブリン親和性を示すことが判明した。フィブリンの存在下または非存在下での改良型APTによるプラスミノーゲンの活性化の程度を調べるために、以下の実験を行った。滴定プレートを使用して、天然に存在するまたは強化された APT を、0.3 mM 合成基質 p-ニロアニリドトリペプチド S-2251 (H-D-Val-leulys-pNA.HCl、Kabi Inc 製) を含む 0.1 M Tris-HCl 緩衝液、pH 7.5 に添加します。）、プラスミンを含まない０．１３μＭのプラスミノーゲン、１２０μｇ／ｍｌのＤＥＳＡＦＩＢＴＭ（ＡｍｅｒｉｃａｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＩｎｃ．製）および０．１％Ｔｗｅｅｎ８０を加え、総量２００μｌとする。このシステムは３７℃に維持される。一定時間後、Titertech Multiscan 310 Modelを使用して405nmの波長で吸光度（光学密度）が測定される。改良されたＡＰＴ（ＶＩ）および天然に存在するＡＰＴのアミド分解活性についての用量反応曲線を図１に示す。 22. DESAFIB TM の添加による用量反応曲線のシフトは、天然に存在する APT では 158 倍の値に相当しますが、改善された APT では 100 倍に達します。これは、DESAFIB TM 薬物の非存在下での改良型 APT (VI) の活性が天然の APT の活性よりも約 1/20 低いという事実によるものです。実施例１０．ウサギの血流における線溶活性についての改善されたＡＰＴの分析。ウサギにおける天然に存在するAPT（n-APT）と本発明の改良型APTの活性を比較することによる薬物動態。図１から分かるように、図２３に示されるように、改良されたＡＰＴは、活性状態における存在の生物学的半減期の顕著な延長を示す（天然のＡＰＴは１〜２分の半減期を示すが、改良されたＡＰＴは生物学的に８〜１５分間活性である）。また、改良型APTは投与後60分経過しても5％（投与30秒後の値を100％）の活性値が残っていることが明らかです（天然APTは60分後に0.1相当の活性を示します）。初期値の .%）。この実験は次のように行われます

体重2.4kgの日本白ウサギを試験に選択した。ペントバルビタール麻酔下で、末梢耳静脈を通じてAPTが投与されます。用量は、改良型APTがウサギ1匹あたり15,400単位（0.8ml）、n-APTがウサギ1匹あたり5,400単位（0.8ml）です（フィブリンプレート法により測定された値）。次に、さまざまな時間間隔 (0.5 ～ 60 分) でカテーテルを使用して大腿動脈から 2.5 ml の血液を採取し、1/9 容量のクエン酸ナトリウム (3.8%) に加えます。採血後30分以内に低速遠心分離を行い、血漿を分離します。分離した血漿を用いて血液中のAPT活性を測定します。（１）ＡＰＴ活性の測定。０．２ｍｌの血漿を３ｍＭの氷酢酸で１６倍に希釈した後、希釈物を低速で遠心分離して沈殿を得る。沈殿物を、血漿容積と等しい容積の１４０ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４に溶解し、ユーグロブリン画分を得る。 APT活性は、このユーグロブリン画分をフィブリン/アガロースディッシュに加えることによって測定されます。プレートを37℃で16時間インキュベートした後、APT活性がプラークとして観察されます。フィブリン/アガロースの標準曲線カップ法動物に投与するために使用されるAPTを0.1〜10,000単位/mlに希釈することによって得られる。このようにして求められた血中APT活性は、投与後30秒後に採血して得られるAPT活性を100%として百分率で表したものである。実施例１１．熱および酸に対する改良型ＡＰＴ（ＶＩ）の安定性。耐熱性を測定するために、改良型APT（VI）と天然APTを、100mM NaClおよび0.01% Tween 80を含む50mM Tris緩衝液（pH 7.4）でそれぞれ100μg/mlの濃度に希釈しました。各溶液を沸騰水（温度98℃）中に2〜60分間保持します。冷却後、残留活性をフィブリンプレート法により測定します。図１に示すように、図２４に示されるように、改良型ＡＰＴ（ＶＩ）の活性の低下は、天然のＡＰＴの活性の低下と比較して有意ではない。たとえば、2 分間の熱処理後、天然 APT の活性は 25% に低下しますが、改良型 APT (VI) は依然として 71% の活性を維持します。耐酸性を調べるため、改良APT(VI)と天然APTを0.5Nに溶解しました。濃度１００μｇ／ｍｌのＨＣｌ溶液を加え、室温で３０分間静置した。中和後、フィブリンプレート法を使用して活性を測定します。改良されたAPTは活性に変化を示さないが、天然のAPTの活性は50%低下する。実施例１２改善されたＡＰＴによる活性リンパ球刺激因子の阻害（ＶＩ）

改良ＡＰＴ（ＶＩ）および天然ＡＰＴを、７％ウシ胎児血清および５８μＭ２－メルカプトエタノールを含有するＰＰＭ１１６４０組織培養培地で適切に希釈した。 100 μl の希釈液を 96 ウェル組織培養プレートにロードし、その後、4 ～ 6 週齢の雄 C3H/He J マウスからの胸腺細胞 (210 7 細胞/ml)、コンカナバリン A (1.2 μg/ml）および50μlのIL-1（4ユニット/ml、Aenzyme Inc）を加え、5％二酸化炭素を含む37℃のインキュベーター内で48時間培養した。次いで、H 3 -チミジンを0.5μの濃度で添加する。立方体インチ/20μl/ウェル。１８時間培養後、細胞をガラス繊維フィルター上に集め、細胞内に導入された 3 Ｈ－チミジン量を液体シンチレーションカウンターで測定し、リンパ球刺激因子の活性を測定する。図２５に示すように、天然型ＡＰＴはリンパ球刺激因子の活性を阻害しないが、改良型ＡＰＴはリンパ球刺激因子の活性を有意に抑制する。溶媒のみでテストした場合、影響は認められませんでした。実施例１３変性タンパク質に基づく抗炎症活性。１）変性タンパク質を取得する。タンパク質溶液 (5 mg/ml) を 0.1 N でインキュベートした後、 HCl溶液または0.1N。 NaOH 溶液を 37℃ の温度で 2 ～ 3 時間処理し、タンパク質溶液を同量の NaOH または HCl で中和します。 2) 変性タンパク質に対する改良型 APT (VI) の親和性。方法：以下の手順に従って、変性タンパク質をニトロセルロースフィルムに「接着」させます。次いで、タンパク質およびニトロセルロースフィルム処理に関連する改善されたAPTの量が測定され、それによって変性タンパク質に対する改善されたAPTの親和性が評価される。ニトロセルロースフィルム片を、140 mM NaClを含む20 mM Tris-HCl緩衝液、pH 7.5に浸漬します。乾燥中。変性タンパク質 (50 μg/10 μl) をニトロセルロースフィルム片上に滴下して放出します。乾燥中。３％ゼラチン溶液でブロッキングする。フラッシング。ニトロセルロースフィルム片を改良APT/1μg/ml/の溶液に浸漬する。フラッシング。プラスミノーゲンと合成基質S-2251を添加し、37℃でインキュベートします（定量分析高度なAPTを吸収します）。 405 nmでの吸光度測定。結果: 表 3 に示すように、改良された APT は、HCl 処理免疫グロブリン G、HCl 処理アルブミン、および NaOH 処理アルブミンに対する親和性を示しました。一方、改善されたAPTは、完全な免疫グロブリンGおよびアルブミンに対して親和性を示さない。３）変性タンパク質による改良型ＡＰＴ（ＶＩ）の活性化。方法：改良型APT活性化因子（変性タンパク質、BrCN処理フィブリノーゲンなど）の反応液に、プラスミノーゲン（10μl中0.0078単位）、3mM合成基質S-2251 100μl、および各種量のTBS緩衝液を添加する。様々な濃度で混合し、０．２７５ｍｌの反応溶液を得た。 Advanced APT (25 µl 中に 2.5 n/g) を反応溶液に添加して、反応を開始します。一定時間反応させた後、反応液に２％ドデシル硫酸ナトリウム（等モル量）を加えて反応を停止する。光学濃度 (OD 405) を測定することにより、改善された APT の活性が決定されます。結果：図２６に示すように、ＮａＯＨ処理アルブミンおよびＨＣｌ処理免疫グロブリンＧは、改善されたＡＰＴの強い活性化効果を示した。特に、HCl処理した免疫グロブリンGの活性は強く、BrCN処理したフィブリノーゲンの活性とほぼ同等であり、濃度は数倍低い。無傷のアルブミンおよび免疫グロブリン G は活性化を示しません。４）改良されたＡＰＴ（ＶＩ）の影響による変性タンパク質の分解。方法：反応系に合成基質S-2251を添加せず、変性タンパク質の量を133μg/gとした以外は前項記載の方法と同様の条件で変性タンパク質と改良型APTを反応させた後、 ml、電気泳動は、β-メルカプトエタノールの存在下、ドデシル硫酸ナトリウムを用いてポリアクリルアミドゲル中で行われる。結果：図２７に示すように、ＮａＯＨ処理またはＨＣＬ処理によって変性したタンパク質は、パターンからのｅｆタンパク質バンドの消失およびその分解を示す分解産物の形成をもたらす。一方、無傷のアルブミンを使用した場合、改良型APTとの相互作用後にefパターンの変化は検出されず、したがって、変性タンパク質の分解は検出されませんでした。

請求

１．２ページに記載のアミノ酸配列を有する組換え組織プラスミノーゲン活性化因子。ここで、Y はグル-イル-リスです。

H 2 N - アミノ末端;

COOH - カルボキシ末端;

R - 活性の変化に関連しない置換および/または欠失および/または挿入を含む直接リンクまたは類似の配列、

そして、以下の特性を有する： 1 2 5 I-フィブリンフィルムを溶解する方法によって測定される線維素溶解活性、フィブリンによって活性化される能力、およびフィブリンの非存在下での改善されたtpAの活性は、フィブリンの活性よりも低い。天然型tpA、天然型と比較して半減期が増加、天然型tpAと比較して、酸や熱に対する耐性、リンパ球活性化因子を阻害する能力、変性タンパク質によって活性化される能力が増加しています。２．ｔｐＡの類似体をコードする配列を含む組換えＤＮＡで形質転換された宿主細胞を培養し、その後標的産物を精製することを含む、組換え組織プラスミノーゲン活性化因子を産生する方法であって、宿主細胞が、 tpA 条項 1 をコードする DNA 配列。

プラスミノーゲンアクチベーター (PA) は、制御型の特異性の高いセリンプロテアーゼです。血液、その他の体液、およびヒトの組織から分離された AP が数多く知られています。それらは生理学的活性化因子に分類され、生成源に応じて、組織（器官）、血管（組織プラスミノーゲン活性化因子）、血漿、血液、尿中（ウロキナーゼ）などになります。微生物から単離されます（ストレプトキナーゼ）。ほとんどすべての AP は酵素前駆体 (プラスミノーゲンプロアクチベーター) の形で形成されます。

プラスミノーゲンの活性化には次のようなものがあります。

外部 - さまざまな要因の影響下で血液中に放出される組織活性化因子、血液、血管壁の影響下。

内部 - 血漿タンパク質の関与 - ハーゲマン因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン。

外因性 - 治療目的でプラスミノーゲン活性化因子（ストレプトキナーゼおよびそれに基づいて作成された薬剤、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ-lys-プラスミノーゲン複合体、遺伝子工学によって得られる組織プラスミノーゲン活性化因子、およびその他の薬剤）を体内に導入した後。

線溶活性化の内因性経路（ハーゲマン依存性線溶）は、血漿のハーゲマン因子（CP因子）によって開始されます。第 XII 因子と高分子量キニノーゲン - プレカリクレイン複合体を外来表面または変化した表面 (コラーゲンなど) に固定した後、限定的なタンパク質分解によって活性型カリクレインが形成され、これが第 XII 因子の活性型である第 XIIa 因子への変換を触媒します。。後者は、プラスミノーゲンからプラスミンへの変換を促進します。遊離カリクレインも直接プラスミノーゲン活性化因子です。

ハーゲマン依存性線溶は、内部機構によるプロトロンビナーゼ形成のための反応カスケードの活性化と同時に活性化され、その主な目的は、血管内凝固の過程で形成されたフィブリン凝固の血管床を浄化することです。血球に含まれる APG は、ハーゲマン依存性線溶の活性化に関与している可能性があります。

外因性プラスミノーゲン活性化経路– 組織損傷の主要な経路であり、さまざまな組織プラスミノーゲン活性化因子によって刺激されます。その中で最も重要なものは組織プラスミノーゲン活性化因子 (tPA) です。 , これは血管の内皮細胞によって合成され、必要に応じて線維素溶解の活性化に費やされます(図13.15)。

図13.15 tPAの構造図

彼の桟橋。質量 70 kDa、構造的に EGF に類似した 1 つのドメイン、2 つのクリングル、およびプラスミンの構造に類似したフィンガー状ドメインを 1 つ持ちます。内皮細胞による tPA の分泌は、血管血栓症の間だけでなく、カフの圧迫時、身体運動中、血管作動性物質 (アドレナリン、ノルエピネフリン) や特定の薬剤の影響下でも起こります。この活性化剤とその阻害剤は、線溶活性を一定に制御します。 tPA は血液の外部線溶活性の 85% を占めます。

構造と作用機序において、tPA はさまざまな組織に含まれる他の線維素溶解活性化因子と類似しており、組織損傷 (外傷、組織破壊、産科病理など) の際に血液に入ります。線維素溶解の組織（器官）因子の中で特別な位置を占めているのは、腎組織および尿路の上皮によって生成される因子です。 ウロキナーゼ、その大部分は尿中に排泄されます。ウロキナーゼは、血液の外部線維素溶解活性の約 10 ～ 15% を提供します。血栓の内部に浸透することができ、そこでプラスミノーゲンからプラスミンへの変換を触媒し、血栓を外側からだけでなく内側からも破壊します。

血中プラスミノーゲン活性化因子血球（赤血球、血小板、白血球）に含まれており、それらの活性化と破壊中、また特にエンドトキシンによって誘発される血栓形成中に放出されます。

外因性活性化因子の中で最も研究されているのは、 ストレプトキナーゼ –非酵素タンパク質（分子量 47 kDa）。β溶血性連鎖球菌によって産生され、通常の状態では血液中に存在しません。デカゼ、セレーゼ、アベリシンなどのストレプトキナーゼは、プラスミンに対して独立した酵素活性を持ちませんが、プラスミノーゲンと結合すると、プラスミノーゲンからプラスミンへの変換を開始する複合体を形成します。したがって、ストレプトキナーゼは、遊離プラスミンの形成を伴う可溶相のプラスミノーゲンだけでなく、フィブリン凝固に関連するプラスミノーゲンも活性化します。連鎖球菌感染では、ストレプトキナーゼが大量に形成される可能性があり、これにより線維素溶解（線溶）が増加し、出血性素因が発症する可能性があります。プラスミノーゲンからプラスミンへの変換、およびフィブリン血餅自体の溶解プロセスは、これらの血餅の表面で起こります。フィブリン凝固はプラスミノーゲンを選択的に吸着して保持します。フィブリン（オーゲン）分子の中央部分に位置するリジンに富んだ領域（LN）は、プラスミノーゲンのクリングルドメインに結合しますが、1つのプラスミノーゲン分子はいくつかのフィブリン（オーゲン）分子に結合するため、プラスミン分子は新しい無傷の分子フィブリンは基質と結合したままであり、α2-アンチプラスミンとの接触による溶液への移行や不活化を回避します。フィブリンクロットは、プラスミノーゲンとともに、プラスミノーゲン活性化因子に特異的に結合します。組織プラスミノーゲン活性化因子は、フィブリンが存在しない場合には触媒活性が低く、フィブリンに結合すると活性化されます。ウロキナーゼを除いて、組織型活性化因子はフィブリノーゲンと比較してフィブリンに対する親和性が高く、これが主な線維素溶解と非常に弱い程度のフィブリノゲン溶解を説明しています。フィブリンの表面にプラスミノーゲンとその活性化因子が同時に存在することで、プラスミンが自然に形成され、フィブリンは、と呼ばれる可溶性フラグメントに分割されます。 フィブリン分解産物(PDF)。

さまざまな PDF は、抗凝固、抗重合、抗凝集などの特性を示します。初期および後期 PDF の決定は、線溶活性の変化、DIC 症候群の段階、一次線溶と二次線溶の区別の早期診断のために行われます。プラスミンもプラスミノーゲン活性化因子も PDP には結合せず、血餅が溶解すると血漿に入り、そこで天然の阻害剤によって不活化されます。

線溶系の重要な構成要素です。プラスミノーゲンアクチベーターは、基底膜、細胞外マトリックスの破壊、および細胞侵入のプロセスに最も頻繁に関与する酵素の 1 つです。それは内皮によって産生され、血管壁に局在する[Loscalso、ea 1988]。組織因子はリンリポタンパク質です。この複合体のアポタンパク質は、分子と一体となった膜糖タンパク質です。重さは約46 kDaで、内皮細胞、平滑筋細胞、単球の膜のリン脂質と密接に関係しています。 TPA は生体内で一本鎖ポリペプチド (分子量 72 kDa) として合成され、プラスミン、組織カリクレイン、活性化第 X 因子などのさまざまなプロテイナーゼによるタンパク質分解によって二本鎖の形態に変換されます。二本鎖型の tPA は、一本鎖前駆体よりも活性が高くなります。アンジオテンシノーゲンをAng IIに変換する際の酵素の作用に最適なpHは酸性領域にあります。 ang II形成酵素としてのtPAを参照。血液中で測定される TPA は、さまざまな刺激の影響下で血流中に放出される内皮活性化因子です。血液中の tPA 濃度は 6.6+/-2.9 ng/ml です。

膜貫通糖タンパク質である組織因子は、クラス II サイトカイン受容体ファミリーのメンバーであり、2 つのメカニズムによって細胞活性化を引き起こすことができます。

内皮細胞および平滑筋細胞に局在する外因性血液凝固機構の活性化のイニシエーターである組織因子は、損傷を受けると血液と接触し、最終的にトロンビンの生成と血液凝固機構の開始に寄与します。血中を循環する f.VII に対して高い親和性を持っています。 Ca++ イオンの存在下では、アポタンパク質 T.f. f.VIIと化学量論的複合体を形成し、その構造変化を引き起こし、Arg-152-Ileペプチド結合の切断によって後者をセリンプロテイナーゼf.VIIaに変換します。この反応は、血液中を循環する微量のプロテイナーゼ (f.Xa、トロンビン、f.VIIa、f.IXa) によって刺激されます。得られた複合体 (f.VIIa-T.f.) は、f.X をセリンプロテイナーゼ f.Xa に変換します。組織因子と第 VII 因子の複合体は、第 X 因子と第 IX 因子の両方を活性化することができ、最終的にはトロンビン a の生成を促進します [Boyle, E.M.、Verrier, E.D., ea. (1996)]。

タンパク質の構造では、T.f. 3 つのドメインが区別されます。主なドメインは表面にあります。細胞膜、膜貫通および細胞質。 219 アミノ酸残基 Ser-1-Glu-219 を含む表面ドメインは受容体機能を持っています。 23 員膜貫通ドメインの後には細胞質の「尾部」が続き、この尾部の助けを借りてタンパク質は膜に固定されます。ここでは、このドメインの単一の Cys 残基が膜脂質 (パルミチン酸またはステアリン酸) とチオエステル結合を形成する能力が実現されています。脂肪族アミノ酸残基には特定の役割が割り当てられており、その助けを借りてタンパク質は膜の内層に組み込まれ、それによって組織因子分子の「固定」が強化されます。表面ドメインは 3 つのスレオニン残基 (Thr-13、Thr-126、Thr-139) でグリコシル化されています。これには、2 つのジスルフィド結合を形成する 4 つの Cys 残基が含まれており、1 つはドメインの N 末端領域に、もう 1 つは C 末端領域にあります。これらの結合は、対応するペプチドループを安定化します。 C末端領域に位置するジスルフィド結合は機能的に重要であることが示されており、第VII因子およびVIIa因子に関連した組織因子の補因子機能の発現にはその関与が必要である。一次構造の分析、ジスルフィド結合の位置、および機能的特徴の研究に基づいて、クラス II サイトカイン受容体ファミリーのインターフェロン Ifn-αR および Ifn-γR との相同性が明らかになりました。血液凝固系では、第 VII/VIIa 因子と受容体 - 補因子 - 組織因子との相互作用により、外部血液凝固機構の活性化が数千倍に加速されます。この加速は次のように達成されます。

まず、血液凝固の第 VII/VIIa 因子 (VII 活性型) と組織因子の複合体の形成によって開始されるタンパク質分解機構により、組織因子は VII/VIIa 因子の補因子およびモジュレーターとして機能します。第 VIIa 因子が組織因子に結合すると、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ (MAP キナーゼ) - Erk-1、Erk-2、p38、Jnk の細胞内 Ca2+ リン酸化が増加し、Egr-1 遺伝子 (初期成長) の転写が引き起こされます。反応）、通常はサイトカインと成長因子によって誘発されます。

第二に、非タンパク質分解機構により、組織因子の細胞質ドメイン自体が細胞内シグナル伝達に関与し、