Лабораторная работа "каталитическая активность ферментов в живых клетках ". Лабораторная работа "каталитическая активность пероксидазы"

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

Определение активности каталазы (1.11.1.6)

1) с помощью перманганата калия и вычислением каталазного числа (метод Баха и Зубковой)

ПРИНЦИП МЕТОДА. Фермент каталаза содержится в большом количестве в эритроцитах, а также во всех тканях и жидкостях организма. Биологическая роль каталазы заключается в обезвреживании пероксида водорода (Н 2 О 2 ) путем его разложения на молекулярный кислород и воду:

2Н 2 О 2 → О 2 + 2Н 2 О

Активность энзима выражают, используя каталазное число и показатель каталазы. Каталазным числом называют количество мг пероксида водорода, которое расщепляется 1,0 мкл крови за определенный промежуток времени. О количестве расщепленного пероксида водорода судят по разности количества перманганата калия, пошедшего на титрование контрольной и опытной проб.

Показателем каталазы называют соотношение каталазного числа к количеству миллионов эритроцитов в 1,0 мкл исследуемой крови.

Реактивы : 1) 1% раствор Н 2 О 2 ; 2) 10% раствор серной кислоты ; 3) 0,1 М раствор перманганата калия (для титрования).

Объект исследования: гемолизат, полученный разведением крови дистиллированной водой в соотношении 1:1000.

Приготовление : в мерную колбу на 100 мл наливают 10 мл дистиллированной воды и прибавляют микропипеткой 0,1 мл крови. Пипетку промывают несколько раз тем же раствором. Воду прибавляют в колбу до метки и получают основной раствор крови (1:1000), который используется для определения каталазного числа.

Ход работы.

В две колбы для титрования (опыт и контроль) наливают по 7 мл воды и в каждую прибавляют по 1 мл основного раствора крови. В каждую колбу вносят точно по 2 мл. В контрольную колбу добавляют 3 мл для расщепления каталазы. Обе колбы инкубируют при комнатной температуре 30 минут. Затем в опытную колбу наливают 3 мл 10% раствора сульфатной кислоты. Содержимое обеих колб титруют 0,1 М раствором перманганата калия до появления розового окрашивания. Умножают разницу между результатами опыта и контроля на 1,7 и получают каталазное число крови.

Пример расчета : моль-эквивалент Н 2 О 2 равняется 17 г. Значит, в 1 мл 0,1 М раствора содержится 1,7 мг Н 2 О 2 ; умножив 1,7 на разницу между количеством мл 0,1 М раствора калий перманганата, пошедшего на титрование содержимого контрольной и опытной колб, получают количество мг Н 2 О 2 , которое расщепляется 1 мкл исследуемой крови, то есть сразу рассчитывают каталазное число.

Нормы : каталазное число составляет от 10 до 15 единиц,

Показатель каталазы составляет 2-3х10 -:6 , в клинике его используют чаще

Клинико-диагностическое значение. Высокая активность каталазы наблюдается при пернициозной и макроцитарной анемии, а также при введении в организм алкоголя, кофеина, ацетоновых тел. Активность каталазы в крови снижается при раке, анемии, туберкулезе и других заболеваниях.

2) с использованием молибдата аммония

Каталаза – один из наиболее филогенетически древних ферментов антиоксидантной системы организма, относится к классу оксидоредуктаз, катализирующих окислительно-восстановительные реакции, входит в группу гидропероксидаз, использующих в качестве субстрата Н 2 О 2 (2 Н 2 О 2 → 2 Н 2 О + О 2 ) или органические гидроперекиси, поэтому наряду с каталазной обладает пероксидазной активностью. По структуре – гемопротеин, содержащий 4 гемовые группы. Каталаза является внутриклеточным ферментом. В циркулирующей крови бóльшая доля фермента локализована в цитоплазме эритроцитов.

Функции каталазы:

Участвует в защите организма от эндогенной перекиси водорода, образующейся в результате функционирования аэробных дегидрогеназ;

Подавляет образование гидроксильных радикалов;

Защищает от окисления гемоглобин и способствует переносу кислорода внутри клеточных структур;

Участвует в окислительном метаболизме некоторых аминокислот;

Предохраняет от окисления SH-группы, в том числе, входящие в активный центр многих ферментов и функционально активных белков.

Принцип метода. Активность каталазы определяется по преобразованию ферментом субстрата (пероксида водорода), который способен к образованию окрашенного комплекса с солями молибдата аммония.

Реагенты. 1) 0,03 % раствор Н 2 О 2 ; 2) 4 % раствор молибдата аммония.

Биологический материал: сыворотка крови.

Ход работы. Опытная проба: к 2,0 мл 0,03 % раствора перекиси водорода добавить 0,1 мл сыворотки. В холостую пробу вместо сыворотки – 0,1 мл дистиллированной воды. В контрольную пробу вместо перекиси добавляют 2,0 мл дистиллированной воды. Пробы инкубировать 10 мин при 37 ° С, затем остановить реакцию добавлением 1,0 мл 4% раствора молибдата аммония. Центрифугировать 10 мин при 4000 об/мин. Измерить оптическую плотность холостой и опытной проб против контроля при длине волны 410 нм.

Расчёт активности каталазы в сыворотке крови:

А (мкат/л) = ,

где Е оп и Е хол - экстинкции опытной и холостой проб,

3,1 – общее разведение,

Т - время инкубации, с,

V - объём вносимой пробы, л,

22,210 3 – коэффициент экстинкции, ммоль –1 см –1 .

Активность каталазы в сыворотке крови 2,6 + 0,5 мкат/л

Оформление работы.

Записывают принцип метода. Фиксируют результаты, делают вывод.

Каталаза – очень распространенный дыхательный фермент, присутствующий практически в любом биологическом материале растений и животных.

В процессе дыхания в качестве побочного продукта окисления веществ образуется перекись водорода, оказывающая в высоких концентрациях токсичное действие на цитоплазму. Обезвреживание перекиси происходит при участии фермента каталазы (одна из его функций), разлагающей ее на воду и молекулярный кислород по уравнению:

каталаза

2 Н2О2 2Н2О +О2

Об активности каталазы судят по объему кислорода, выделяющегося в результате разложения перекиси водорода.

Для определения пользуются прибором, который состоит из каталазника, бюретки емкостью 50 мл и стеклянной груши, соединенных каучуковыми трубками и стеклянным тройником, каучуковая трубка на конце тройника снабжена винтовым замком. Бюретка и стеклянная груша закреплены на штативе. Их заполняют дистиллированной водой до половины объема.

ХОД РАБОТЫ

0,5 г листьев растирают в фарфоровой ступке с кварцевым песком и добавляют 0,5 г мела для создания щелочной реакции (рН=7,7 оптимальная для данного фермента).

Во время растирания вливают небольшими порциями 20 мл воды, смесь вносят в одно колено каталазника. В другое колено помещают 5 мл 3%-ной перекиси водорода. Каталазник соединяют с каучуковой трубкой, не допуская смешивания жидкостей.

Открывают зажим и перемещением воронки устанавливают уровень воды в бюретке на нуле. Закрывают зажим и быстрым изменением положения каталазника смешивают жидкость в обоих коленах. Затем все время потряхивая каталазник по снижению уровня воды в бюретке отмечают объем кислорода в мл, выделенного в течении 3 минут на 1 г массы сырого материала.

Во время опыта каталазник нельзя держать всей ладонью, так как при нагревании от руки воздух в колбе расширяется, что может повлиять на точность отсчета. При отсчете вода в круглой воронке и бюретке должна быть на одном уровне.

Определяют активность каталазы в листьях верхнего и нижнего ярусов. Можно использовать также проростки различных сортов сельскохозяйственных культур, различающихся по скороспелости к неблагоприятным воздействиям.

Результаты опыта заносят в таблицу:

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) растение с несколькими ярусами листьев, проростки пшеницы или другой культуры; 2) промытый речной песок; 3) порошок мела; 4) 3%-ный раствор перекиси водорода; 5) фарфоровые ступки с пестиком; 6) мерные цилиндры на 25 мл; 7) прибор для определения каталазы; 8) часы; 9) весы с разновесами.

Принцип метода: молибденовокислый аммоний с раствором перекиси водорода образует комплексное соединение желтого цвета. Каталаза разрушает перекись водорода по следующей формуле:

2Н 2 О 2 = 2Н 2 О + О 2

Степень снижения интенсивности окраски раствора пропорциональна активности каталазы.

Ход работы: в опытную и контрольную пробирку вносят по 4 мл 0,03% раствора перекиси водорода, в опытную пробирку добавляют 0,2 мл гемолизированной крови (разведение 1:1000). Ингибируют пробу 20 минут при 37 0 С. Затем в обе пробирки вносят по 2 мл раствора молибдата аммония, а в контрольную – дополнительно 0,2 мл гемолизата. Перемешивают. Измеряют оптическую плотность опытной и контрольной пробы против воды при синем светофильтре. Определяют активность каталазы по формуле:

(Е к – Е 0) . 5600

А= -------------------, где

А –активность каталазы (мкмоль Н 2 О 2 / мин на мл крови);

Е к –экстинция контроля; Е 0 – экстинция опыта;

В – время инкубации, мин; 5600 – коэффициент

В норме активность каталазы составляет 135 мкмоль Н 2 О 2 / мин на мл

крови (в слюне –12-16 мкмоль). Активность каталазы в крови может снижаться при анемии, опухолевом росте, туберкулезе, некоторых других заболеваниях, а повышаться при острых воспалительных процессах (в слюне – при воспалительных процессах слизистой ротовой полости).

Аргументировано и кратко ответить на следующее:

1. Может ли осуществиться окисление СН 3 - СН 2 - СН 2 - ОН ®

СН 3 - СН 2 - СН = О в бескислородной среде? Какие условия для этого необходимы? Написать схему реакции.

2. Может ли и при каком условии в бескислородной среде произойти окисление по типу СН 3 - СН 2 - СН = О ® СН 3 - СН 2 – СООН? Укажите необходимые компоненты, составьте схему реакции. Как пояснить появление двух атомов кислорода в продукте реакции.

3. Является ли кислород исключительным (единственным) конечным акцептором водорода в цепи тканевого дыхания и вообще в биологическом окислении?

4. Почему окисление в живой природе отождествляли с горением вне организма? Назовите внешние признаки сходства между горением и процессом окисления в организме. Назовите отличия между этими процессами.

5. Напишите реакции дегидрирования соединений:

R-СН 2 –СН 2 - R; R-СН=О; R- СНОН -R; R-СН=СН-R

6. Установите соответствие:

Редокс-потенциал: А.+0,82; Б. +0,10; В.+ 0,25; Г.- 0,22

Компонент ЦПЭ: 1.Убихинон; 2.Кислород; 3.ФМН; 4.Цитохром

7. Какие из перечисленных соединений являются субстратами ФАД-зависимой дегидрогеназы: глюкоза, сахароза; янтарная кислота; глицериновый альдегид, НАДН + .

8. Напишите схему переноса электронов и протонов от изоцитрата на кислород (изоцитратдегидрогеназа – НАД-зависимый фермент) и укажите

название всех ферментных комплексов.

9. Лекарственные препараты – производные барбитуровой кислоты:

А. Оказывают снотворное действие.

Б. Активируют тканевое дыхание.

В. Ингибируют НАДН-дегидрогнназу.

Д. Вызывают гипоэнергетическое состояние.

Ферменты являются белковыми катализаторами биохимических реакций, большая часть которых в отсутствие фермента протекала бы крайне медленно. В отличие от химических катализаторов каждый фермент способен катализировать лишь очень небольшое число реакций, часто только одну.

Таким образом, ферменты это реакционно-специфические катализаторы. Практически все биохимические реакции катализируются ферментами.

Многие ферменты оказывают каталитическое действие на субстраты только в присутствии специфического термостабильного низкомолекулярного органического соединения – кофермента.

В таких случаях холофермент (каталитически активный комплекс) состоит из апофермента (белковая часть) и связанного с ним кофермента (Приложение Н). Кофермент может быть связанным с апоферментом ковалентными и нековалентными связями. Термин «простетическая группа» относится к ковалентно связанному коферменту. К числу реакций, требующих присутствия кофермента, относятся: окислительно-восстановительные, переноса групп, изомеризации, а также реакции конденсации (по системе IUB это классы 1, 2, 5, 6). Реакции расщепления протекают в отсутствие коферментов (по системе IUB это классы 3 и 4).

^ 4.1 Лабораторная работа «Определение активности амилазы
солода по методу Вольгемута»

Метод Вольгемута основан на определении минимального количества фермента, способного при определенных условиях полностью гидролизовать 1 мл 0,1 %-ного раствора крахмала. Амилазная активность солода выражается количеством миллилитров 0,1 %-ного раствора крахмала, которое может быть гидролизовано 1 мл вытяжки из солода при температуре 38 °С в течение 30 мин. В норме амилазная активность равна от 160 до 320 единиц активности.

Метод Вольгемута широко используется в клинической практике для определения амилазной активности крови и мочи, в пивоварении – для определения амилазной активности солода. Резкое повышение амилазной активности в крови и моче (в 10–30 раз) наблюдается при острых панкреатитах, опухолях поджелудочной железы.

^ Материалы и реактивы: вытяжка из солода зерновых, разбавленная в 10 раз; 0,1 %-ный раствор крахмала; 0,1 %-ный раствор йода в 0,2 %-ном растворе иодида калия.

Оборудование: штатив с пробирками, пипетки, капельницы, термостат.

^ Ход работы. В десять пробирок наливают по 1 мл дистиллированной воды. В первую пробирку прибавляют 1 мл разведенной в 10 раз вытяжки, перемешивают, 1 мл смеси переносят во вторую пробирку. Содержимое этой пробирки снова перемешивают и 1 мл переносят в третью пробирку и так до десятой пробирки. Из последней пробирки отбирают 1 мл и выливают. Таким образом, в каждой последующей пробирке содержание фермента в два раза меньше, чем в предыдущей. Разведение вытяжки в десяти пробирках составит: 1:10; 1:20; 1:40; 1:80; 1:160; 1:320; 1:640; 1:1280; 1:2560; 1:5120; 1:10240.

Далее во все пробирки прибавляют по 1 мл воды и по 2 мл раствора крахмала, перемешивают и помещают в термостат при температуре 38 °С на 30 мин. После инкубации пробирки охлаждают водопроводной водой для прекращения действия фермента, добавляют по две капли раствора йода, хорошо взбалтывают и наблюдают за изменением окраски. При реакции с йодом жидкость окрашивается в желтый, розовый и фиолетовый цвет.

Отметив, при каком разведении произошел полный гидролиз крахмала с минимальным содержанием фермента (пробирка с желтоватой окраской содержимого), по количеству неразведенной вытяжки (А) в данной пробирке рассчитывают амилазную активность вытяжки
(А мл вытяжки расщепляет Х мл 0,1 %-ного раствора крахмала).

Например, желтый цвет появился в четвертой пробирке, где вытяжка разведена в 160 раз. Это количество вытяжки способно гидролизовать 2 мл 0,1 %-ного раствора крахмала, а 1 мл неразведенной вытяжки в тех же условиях гидролизует 320 мл: Х = 2×160/1. Следовательно, амилазная активность равна 320.

^ 4.2 Лабораторная работа «Определение активности каталазы

по Баху»

Метод основан на определении количества пероксида водорода, оставшегося после действия на него каталазы, титрованием на него раствора KMnO 4 . Реакция протекает по уравнению

1 мл 0,1 моль/л раствора перманганата калия соответствует 85 мг пероксида водорода.

^ Материалы и реактивы: препарат каталазы (1 г проростков солода ячменного растирают в фарфоровой ступке с 6 мл фосфатного буфера и фильтруют); 10 %-ный раствор H 2 SO 4 ; 0,1 %-ный раствор пероксида водорода на фосфатном буфере, pH=7,0 (35,0 мл 0,2 моль/л NaH 2 PO 4 в 13,6 мл 0,2 моль/л NaH 2 PO 4); 0,1 моль/л раствор KMnO 4 .

Оборудование: колбы емкостью 100 мл, пипетки, бюретки, термостат.

^ Ход работы. В две колбы вносят по 2 мл препарата каталазы, в одну из них (проба) прибавляют 1 мл 10%-ного раствора H 2 SO 4 , затем наливают по 2 мл раствора пероксида водорода в каждую колбу, ставят в термостат на 40 мин при температуре 38 °С. По истечении времени инкубации во вторую колбу (контроль) прибавляют 1 мл 10 %-ного раствора H 2 SO 4 и оба раствора титруют 0,1 моль/л раствором KMnO 4 до появления стойкого розового окрашивания от излишка перманганата калия.

Активность каталазы определяют по количеству разложенного пероксида водорода (мл) и рассчитывают по формуле:

,

Где
– разность результатов титрования контрольного и исследуемого образцов 0,001 н раствором KMnO 4 , мл;

Q – количество пероксида водорода (85 мг), соответствующее
1 мл 0,1 моль/л раствора KMnO 4 .

^ 4.3 Лабораторная работа «Капельный метод
(по Климовскому и Родзевич)»

Амилолитическая активность, обусловленная в основном наличием в препарате α-амилазы, характеризует способность фермента катализировать гидролиз крахмала до неокрашиваемых йодом продуктов. При наличии в препарате α-амилазы и глюкоамилазы этим методом определяется суммарное действие всех амилолитических ферментов.

За единицу амилолитической активности в этом методе принято такое количество фермента, которое катализирует расщепление 1 г растворимого крахмала до продуктов, неокрашиваемых йодом, за 1 час при температуре 30 ºС в строго определенных условиях. Амилолитическую активность АС выражают числом указанных единиц в 1 г препарата, культуры или в 1 см 3 раствора. Величина АС показывает, сколько граммов крахмала может быть гидролизовано до неокрашиваемых йодом соединений 1 г препарата, культуры или 1 см 3 раствора за 1 ч в условиях определения. Окончание реакции контролируют визуально по йодной пробе.

Чувствительность метода определяют минимальным количеством времени, за которое можно визуально уловить изменение окраски йода. Допускают, что скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна количеству применяемого фермента и остается постоянной на протяжении от 5 мин до 1 ч, то есть реакция подчиняется закону реакции нулевого порядка. Кроме того, установлено влияние величины рН и химической природы буфера на величину АС. С ацетатным буфером (рН=4,7) величина АС у грибных препаратов в среднем в 1,5 раза выше, чем при определении с фосфатным буфером (рН=6,0). Поэтому, при определении величины АС грибных культур рекомендуется брать ацетатный буфер.

Недостатком метода является нечеткость визуального определения окончания реакции.

^ Материалы и реактивы: ацетатный буфер с рН=4,7 для ферментов грибного происхождения; фосфатный буфер с рН=6,0 для ферментов бактериального происхождения; 1 %-ный раствор крахмала (раствор крахмала, употребляемый для анализа грибных препаратов, должен иметь рН=4,7, для анализа бактериальных препаратов – 6,0); растворы йода. Для приготовления основного раствора йода в тарированный стаканчик с притертой крышкой отвешивают 4,4 г йодида калия, 1,4 г металлического йода, добавляют около 2 см 3 дистиллированной воды. Стаканчик закрывают крышкой, содержимое перемешивают и после растворения йода переводят раствор в мерную колбу объемом 100 см 3 с притертой пробкой. Доводят объем дистиллированной водой до метки. Содержимое колбы хранят в темном прохладном месте. Основным раствором йода можно пользоваться в течение 30 дней со дня его приготовления. Рабочий раствор йода готовят из основного раствора. Для этого 20 см 3 основного раствора йода наливают в мерную колбу вместимостью 100 см 3 , добавляют 4,4 г йодида калия и доводят общий объем раствора до 100 см 3 . Рабочий раствор йода может быть употреблен в течение шести дней после его приготовления.

Оборудование: широкие пробирки, стеклянные палочки, пипетки, стаканы объемом 50 мл, чашки Петри, термостат.

^ Ход работы. Для определения значения АС важно строго соблюдать условия реакции. Для этого предварительно все растворы – субстрат (1 %-ный раствор крахмала), раствор фермента и дистиллированная вода должны быть нагреты до температуры 30 °С.

Субстрат в количестве 25 см 3 (12,5 мл) помещают в широкую пробирку, в которую вставлена стеклянная палочка. 30 см 3 (15 мл) вытяжки и 30 см 3 (15 мл) воды наливают в отдельные пробирки, помещают в термостат и выдерживают при температуре 30 ºС в течение
10 минут.

Затем в широкую пробирку к раствору крахмала, не вынимая пробирок из термостата, с помощью пипеток добавляют от 1 до 25 см 3 исходного ферментного раствора и соответствующее количество воды так, чтобы общий объем реакционной смеси был 50 см 3 . Если ферментная вытяжка малоактивна, то можно внести только ее в количестве 25 см 3 , а воду вообще не добавлять.

Содержимое пробирки перемешивают палочкой и отмечают время по секундомеру, когда была добавлена вытяжка к раствору крахмала. Через каждые 60 секунд из пробирки, не вынимая ее из термостата, отбирают палочкой каплю пробы. Каплю помещают на белую фарфоровую пластину, соединяют эту каплю с каплей рабочего раствора йода и наблюдают окраску. Реакция расщепления крахмала считается оконченной, когда йод перестает давать изменение окраски при соединении с каплей испытуемого раствора в течение первых 10 секунд. Изменение окраски отчетливо видно на границе соприкосновения двух капель – йода и реакционной смеси.

Время, за которое происходит расщепление крахмала до продуктов, не окрашивающихся йодом, должно быть в пределах от 10 до
20 минут.

Если время гидролиза менее 10 мин, определение повторяют, беря на гидролиз меньше вытяжки и больше воды. Если гидролиз не заканчивается в течение 20 мин, то анализ также повторяют, беря на определение больше ферментной вытяжки и меньше воды. Количество ферментной вытяжки, которое необходимо брать на повторный анализ, вычисляют с учетом полученного времени гидролиза.

Если ферментная вытяжка имеет малую или слишком высокую активность, и количество ферментного раствора от 1 до 25 см 3 не обеспечивает длительности гидролиза крахмала в течение 10…20 мин, то для анализа берут не 25 см 3 раствора крахмала, а большее или меньшее его количество, например, 10 или 40 см 3 , внося соответствующую поправку в расчетную формулу (соответственно 0,1 или 0,4 вместо, обычных 0,25).

Величину значения амилолитической активности АС (ед./г) рассчитывают по формуле:

Где 0,25 – количество крахмала, которое находится в 25 см 3 1 %-ного раствора, г;

60 – коэффициент пересчета на 1 ч;

N – количество фермента, участвующего в реакции, г или см 3 (эта величина определяется с учетом концентрации исходной вытяжки и последующего разведения);

T – время, за которое произошло расщепление крахмала до не окрашиваемых йодом продуктов, мин.

Пример. Для анализа взята ферментная вытяжка воздушной культуры гриба. Исходный раствор приготовлен из расчета 5 г культуры в 100 см 3 забуференной воды. Известно, что данная культура очень активна, поэтому сделано дополнительное разведение исходного раствора: 20 см 3 доведено в мерной колбе до 50 см 3 дистиллированной водой и оттуда на анализ взято 2 см 3 , т.е. получена такая последовательность разведения:

5 г → 100 см 3 → 20 см 3 → 50 см 3 → 2 см 3 .

Для гидролиза 0,25 крахмала (25 см 3 1 %-ного раствора крахмала) ферментным раствором последнего разведения (2 см 3) потребовалось 12 мин. Тогда АС воздушно-сухой культуры (ед./г) составит:

При пересчете ферментативной активности следует учитывать не абсолютно сухое вещество ферментного препарата, а с учетом влажности. Расчет следует производить по формуле:

,

Где W – влажность культуры или препарата.

^ 4.4 Лабораторная работа «Метод Вильштеттера
и Вальдшмидта-Лейтца определения протеолитической
активности ферментов в модификации»

Метод основан на определении свободных карбоксильных групп в спиртовых растворах аминокислот и полипептидов.

Активность (ПС) выражается количеством миллиграммов аминного азота, которое образуется при гидролизе определенного количества 5 %-ного раствора желатина с величиной рН от 7,3 до 7,5 1 г препарата или 1 см 3 ферментного раствора за 1 ч при температуре 40 ºС.

За единицу протеолитической активности принимается количество фермента, которое образует 1 мг аминного азота за 1 ч при принятых условиях опыта.

^ Материалы и реактивы: 96 %-ный этиловый спирт; 1 %-ный раствор тимолфталеина; 0,1 н раствор NaOH; субстрат – 5 %-ный раствор желатина; вытяжка из анализируемого растения.

Приготовление вытяжки для определения протеолитической активности: навеска 0,25 г растительного материала помещается в фарфоровую ступку и растирается в течение 2,5 мин с 2,5 мл фосфатного буфера (рН=7,3), далее масса фильтруется.

Приготовление 5 %-ного раствора желатина (субстрат): 5 г желатина предварительно замачивается в стеклянном стаканчике в 15…20 см 3 дистиллированной воды в течение 20…30 мин. Набухший белок заливается 20…25 см 3 буферного раствора с температурой от 70 до 80 °С и тщательно перемешивается стеклянной палочкой. Растворившаяся часть сливается в мерную колбу объемом 100 см 3 , к нерастворившейся части добавляется еще 20…25 см 3 буферного раствора, и полученный раствор снова переносится в эту же колбу. Охлажденный до 40 °С раствор желатина доводится до метки буферным раствором такой же температуры. Готовый раствор желатина хранится в холодильнике при температуре от 2 до 5 °С и используется для анализа в течение двух суток. Перед анализом раствор желатина нагревается до температуры 40 °С на водяной бане.

Оборудование: конические колбы объемом от 200 до 250 мл, мерные колбы объемом 50 мл, стеклянные палочки, пипетки, бюретки, термостат.

^ Ход работы. К 10 см 3 5 %-ного раствора желатина с величиной рН от 7,3 до 7,5 приливают 2 см 3 испытуемого ферментного раствора и сразу же отбирают 1 см 3 реакционной смеси в коническую колбу емкостью от 50 до 100 см 3 , куда предварительно наливают 20 см 3 96 %-ного этилового спирта и 0,2 см 3 1 %-ного тимолфталеина. Пробу титруют 0,1 н раствором NaOH до появления голубой окраски.

Оставшуюся смесь желатина с ферментным раствором помещают в термостат с температурой 40 ºС для гидролиза. Через 3 ч 1 см 3 реакционной смеси отбирают во вторую колбу емкостью от 50 до 100 см 3 , куда предварительно наливают 20 см 3 96 %-ного этилового спирта и 0,2 см 3 1 %-ного тимолфталеина. Пробу титруют, как в случае контрольного варианта.

Расчет протеолитической активности ПС проводят по формуле:

,

Где А – количество аминного азота, накопленного за время опыта из реакционной среды, мл;

T – продолжительность протеолиза, ч;

Р – коэффициент, учитывающий разведение и пересчет на 1 г препарата или 1 см 3 жидкого ферментного раствора.

Величину А рассчитывают по формуле:

,

Где а – количество 0,1 н раствора NaOH, пошедшее на титрование 1 см 3 опытной пробы, см 3 ;

А к – то же для контрольной пробы;

1,4 – коэффициент пересчета количества 0,1 н раствора щелочи в миллиграммы азота аминокислот и полипептидов;

К – поправка к титру щелочи.

(По А.Н. Баху и А.И. Опарину)

Все разнообразные превращения, которые составляют основу жизнедеятельности организма, протекают при участии биологических катализаторов - ферментов, которые являются специфическими белками.

Благодаря ферментам проявляется одна из замечательных особенностей живых клеток - способность к осуществлению сложнейших реакций в очень короткое время и при сравнительно низкой температура тела. Биологическое значение этого явления очень велико.

Для изучения действия ферментов необходимо выделить их из живых тканей. Обычно для этой цели подбирают легко доступный источник, богатый данным ферментом. Для того, чтобы перевести фермент в раствор, необходимо разрушить клеточные оболочки, что достигается с помощью гомогенизатора, растирания в ступке с пестиком, замораживания и оттаивания, автолиза и др. Обычно, разрушение клеточных оболочек производят при низкой температуре, благодаря чему приостанавливаются все ферментативные процессы в тканях.

К группе окислительно-восстановительных ферментов относится гемсодержащий ферменткаталаза , которая катализирует реакцию разложения перекиси водорода с освобождением молекулярного кислорода:

2 Н 2 О 2 --> 2 Н 2 О + О 2

Каталаза находится в большинстве тканей живого организма.

Принцип метода.

Перекись водорода разлагается каталазой. Избыток перекиси водорода титруют перманганатом калия в кислой среде. Реакция идет по уравнению:

2 KMnO 4 + 5 H 2 O 2 + 3 H 2 SO 4 --> 2 MnSO 4 + K 2 SO 4 + 8 H 2 O + 5 O 2

В опыте определяют количество оставшейся неразрушенной перекиси водорода, в контроле - общее количество взятой перекиси водорода (каталаза в контрольной пробе инактивирована кипячением).

Вычитая результаты опыта из результатов контроля, узнают количество разрушенной в определенный промежуток времени перекиси водорода, что позволяет судить об активности каталазы.

Оборудование: 1. Бюретки прямые на 50 и 100 мл (по 1 шт.)

2. Цилиндр на 10 мл

3. Ступка с пестиком

4. Конические колбы на 200-250 мл (2 шт.)

5. Технические весы с разновесами

6. Пипетка на 10 мл "вытяжка фермента"

7. Пипетка "H 2 SO 4 "

8. Кипящая водяная баня

9. Шпатель

10. Колба мерная на 100 мл

11. Воронка

12. Фильтровальная бумага

Материалы: 1. Свежий растительный материал (морковь или картофель)

2. 0.1н раствор Н 2 О 2

3. 0.1н раствор KMnO4

4. 10%-ный раствор H 2 SO 4

5. СаСО 3 (крист.)

6. Песок кварцевый

Ход работы:

2 г сырого картофеля (или моркови) растирают с кварцевым песком в ступке, постепенно добавляя 2-3 мл воды. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике шпателя карбонат кальция до прекращения выделения пузырьков углекислого газа. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу и доводят водой до 100 мл. Смесь оставляют стоять в течение 30-60 мин, после чего ее фильтруют.

В коническую колбу на 200 мл берут из бюретки 25 мл 0.1н раствора перекиси водорода и добавляют туда же пипеткой 20 мл вытяжки фермента. Через 30 мин действие фермента прекращают прибавлением 5 мл 10%-ного раствора серной кислоты и титруют смесь 0.1н раствором перманганата калия (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин розового окрашивания). Отмечают количество миллилитров раствора перманганата калия, пошедшего на титрование оставшейся перекиси водорода.

Одновременно ставят контроль с инактивированным нагреванием в кипящей водяной бане в течение 5 мин ферментным раствором (20 мл) К этому раствору после охлаждения добавляют 25 мл 0.1н раствора перекиси водорода. Смесь оставляют стоять на 30 мин, после чего добавляют 5 мл 10%-ного раствора серной кислоты и титруют 0.1н раствором перманганата калия. Отмечают количество миллилитров перманганата калия, пошедшего на титрование всего количества пе­рекиси водорода.

По разности между опытным и контрольным титрованием находят количество перманганата, эквивалентное количеству разложенной пе­рекиси водорода. Согласно уравнению реакции между KMnO 4 и H 2 O 2 , 1 мл 0.1н раствора перманганата калия соответствует 1.7 мг перекиси водорода.

Пример расчета.

Из 1.25 г моркови приготовлена вытяжка каталазы объемом 100 мл. На титрование опытной пробы затрачено 15.5 мл,контрольной-30.2 мл 0.1н раствора перманганата калия. Количество разложенной перекиси водорода в пробе эквивалентно 30.2-15.5=14.7 мл 0.1н раствора перманганата калия и, следовательно, равно 14.7*1.7=24.99 мг.

В 1 г сырой моркови содержится количество каталазы, способное за 30 мин разложить (24.99*100)/(20*1.25)=99.96 мг перекиси водорода, а за 1 мин - 99.96/30=3.33 мг. Так как

1 мкмоль перекиси водорода составляет 0.034 мг, то в 1 г моркови присутствует 33.3/0.034=100 Е каталазы.

Лабораторная работа №4

Получение сахаразы из дрожжевых клеток. Специфичность действия ферментов.

Все разнообразные химические превращения, которые составляют основу жизнедеятельности организма, протекают при участии биологических катализаторов - ферментов, которые являются с п е ц и ф и ч е с к и м и б е л к а м и.

Благодаря ферментам проявляется одна из замечательных особенностей живых клеток - способность к осуществлению сложнейших реакций в очень короткое время и сравнительно при низкой температуре тела.

Изучение свойств ферментов, условий их действия, определение содержания ферментов в различных органах и тканях имеет большое значение для правильного понимания сложнейших процессов жизнедеятельности организма.

Одним из важнейших свойств ферментов является специфичность их действия в отношении определенного субстрата. Специфичность каталитических свойств ферментов проявляется в том, что фермент, как правило, действует лишь на определенное вещество. На строгую специфичность ферментов указывает и тот факт, что в случаях стереоизомерии определенный фермент катализирует расщепление только одного стереоизомера. Специфичность ферментов - их важнейшее биологическое свойство, без которого невозможен упорядоченный обмен веществ.

В данной работе рассматриваются процессы расщепления ферментом сахаразой субстрата - сахарозы и расщепления крахмала ферментом - амилазой, которая содержится в слюне человека.

Экстракция сахаразы из дрожжевых клеток

Материалы и реактивы:

· Прессованные дрожжи– 10 г

· Гомогенизатор (ступка с пестиком)

· Кварцевый песок

· Вода дистиллированная

Ход работы

10 грамм сухих дрожжей поместить в ступку, добавить 10 мл дистиллированной воды и гомогенизировать в фарфоровой ступке с небольшим количеством кварцевого песка для разрушения клеточных стенок. Затем фарфоровую ступку с гомогенизатом поместить в сушильный шкаф с температурой 60 0 Сна 30-40 минут.

По истечении указанного времени вынуть ступку, охладить, добавить 30 мл дистиллированной воды и растереть содержимое ступки до однородной массы.

Затем гомогенизат, для осаждения клеточной массы, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 минут. Полученная надосадочная жидкость – экстракт сахаразы.