Metodi meccanici per isolare una coltura pura di aerobi. Determinazione del numero di cellule mediante semina su terreni nutritivi solidi (metodo della piastra Koch)
8. Metodi per isolare colture pure di microrganismi
La coltivazione dei microrganismi, oltre alla composizione del mezzo nutritivo, dipende fortemente da fattori fisici e chimici (temperatura, acidità, aerazione, luce, ecc.). Inoltre, gli indicatori quantitativi di ciascuno di essi non sono gli stessi e sono determinati dalle caratteristiche metaboliche di ciascun gruppo di batteri. Esistono metodi per coltivare microrganismi in mezzi nutritivi solidi e liquidi in condizioni aerobiche, anaerobiche e di altro tipo.
Metodi per isolare colture pure di microrganismi aerobici. Per ottenere colonie isolate, durante l'applicazione il materiale viene distribuito in modo che le cellule batteriche siano distanti tra loro. Per ottenere una coltura pura, vengono utilizzati due gruppi principali di metodi:
a) metodi basati sul principio della separazione meccanica dei microrganismi;
b) metodi basati sulle proprietà biologiche dei microrganismi.
Metodi basati sul principio della separazione meccanica dei microrganismi
Setacciatura con una spatola secondo Drigalski. Prendere 3 piastre Petri con terreno nutritivo. Applicare una goccia del materiale di prova sulla prima tazza con un'ansa o una pipetta e strofinarla con una spatola su tutta la superficie dell'agar nutriente. Quindi la spatola viene trasferita nella 2a tazza e la coltura rimasta sulla spatola viene strofinata sulla superficie del mezzo nutritivo. Successivamente, la spatola viene trasferita nella 3a tazza e la semina viene eseguita allo stesso modo. Sulla 1a piastra cresce il numero massimo di colonie, sulla 3a piastra cresce il numero minimo. A seconda del contenuto di cellule microbiche nel materiale in studio, su una delle piastre crescono singole colonie adatte ad isolare una coltura pura del microrganismo.
Metodo di Pasteur (metodo di diluizione). Una serie di diluizioni seriali successive, solitamente decuplicate, viene preparata dal materiale studiato in un mezzo liquido sterile o in una soluzione fisiologica in provette. Successivamente, il materiale viene seminato con un prato di 1 ml da ciascun tubo. Si presume che in alcune provette rimanga un numero di microrganismi che possono essere contati quando seminati su terreni in piastra. Questo metodo consente di calcolare il numero microbico nel materiale in esame. (La conta microbica è il numero di colonie sull'ultima piastra di crescita microbica moltiplicato per il tasso di diluizione del materiale).
Ottenere una coltura pura setacciando in profondità il metodo Koch medio (metodo di riempimento). Il materiale di prova in una piccola quantità viene aggiunto a una provetta con MPA fuso e raffreddato a 45-50°C, miscelato, quindi una goccia del mezzo nutritivo con il materiale diluito viene trasferita in una seconda provetta con MPA fuso, ecc. . Il numero di diluizioni dipende dal numero previsto di microrganismi nel materiale in studio. Le diluizioni preparate dei microbi vengono versate dalle provette in piastre Petri sterili, contrassegnate con numeri corrispondenti ai numeri delle provette. Dopo che il mezzo con il materiale di prova si è gelificato, le tazze vengono poste in un termostato. Il numero di colonie nelle piastre del terreno di coltura diminuisce man mano che il materiale viene diluito.
Semina ad ansa (semina a colpi). Prendere una capsula Petri con agar nutriente e dividerla in 4 settori, tracciando delle linee di demarcazione all'esterno del fondo della capsula. Il materiale di prova viene inserito nel primo settore tramite un'ansa e lungo tutto il settore vengono tracciate delle linee parallele ad una distanza di circa 5 mm l'una dall'altra. Utilizzando lo stesso cappio, senza cambiarne la posizione rispetto all'agar, tracciare le stesse linee su altri settori della capsula. Nel luogo in cui un gran numero di cellule microbiche si depositano sull'agar, la crescita dei microrganismi avverrà sotto forma di una striscia continua. Nei settori con un piccolo numero di cellule crescono le singole colonie. In alternativa, le soluzioni di coltura mista diluite possono essere versate sulla superficie dei terreni solidi nelle piastre.
Metodo di filtraggio. Si basa sul passaggio del materiale in esame attraverso speciali filtri con un certo diametro dei pori e sulla separazione dei microrganismi contenuti per dimensione. Questo metodo viene utilizzato principalmente per la purificazione dei virus dai batteri, nonché per la produzione di fagi e tossine (nel filtrato - fago puro, tossina purificata).
Metodi basati sulle proprietà biologiche dei microrganismi
Creare condizioni ottimali per la riproduzione
Creazione di un regime di temperatura ottimale per la soppressione selettiva della riproduzione della microflora associata a basse temperature e l'ottenimento di colture di batteri psicrofili o termofili. La maggior parte dei microbi si sviluppa bene a 35-37°C, Yersinia cresce bene a 22°C, Leptospira viene coltivata a 30°C. I batteri termofili crescono a temperature esterne agli intervalli di temperatura di altre specie batteriche associate (ad esempio, il Campylobacter viene coltivato a 42°C).
Creare condizioni per aerobiosi o anaerobiosi. La maggior parte dei microrganismi cresce bene in presenza di ossigeno atmosferico. Gli anaerobi obbligati crescono in condizioni che escludono la presenza di ossigeno atmosferico (agenti causali del tetano, botulismo, bifidumbatteri, batterioidi, ecc.). I microrganismi microaerofili crescono solo a basso contenuto di ossigeno e ad alto contenuto di CO 2 (Campylobacter, Helicobacter).
Metodo di arricchimento. Il materiale in studio viene inoculato su terreni nutritivi selettivi che promuovono la crescita di un certo tipo di microrganismo.
Metodo Shukevich. Il materiale da testare viene inoculato nell'acqua di condensa dello slant dell'agar. Durante la riproduzione, forme mobili di microbi provenienti dall'acqua di condensa si diffondono in tutto l'agar, come se "strisciassero" sulla sua superficie. Setacciando i bordi superiori della coltura nell'acqua di condensazione dell'agar appena tagliato e ripetendo l'operazione più volte, è possibile ottenere una coltura pura. Pertanto, per isolare la coltura di Proteus vulgaris, Clostridium tetani, il materiale viene inoculato in acqua di condensa sul fondo di una provetta con un terreno denso e inclinato, senza toccare la superficie del terreno. Questi microrganismi sono capaci di crescita strisciante (sciamatura) sulla superficie del terreno. I microbi associati crescono nella parte inferiore del mezzo nutritivo, mentre i microbi del proteo e del tetano sotto forma di pellicola si diffondono verso l'alto e occupano l'intera parte inclinata dell'agar.
Metodo di riscaldamento. Permette di separare i bacilli sporigeni dalle forme non spore. Riscaldare il materiale da testare a bagnomaria a 80°C per 10-15 minuti. In questo caso le forme vegetative muoiono e le spore si preservano e germinano quando seminate su un terreno nutritivo appropriato.
Metodo batteriostatico (metodo di inibizione). Basato sui diversi effetti di alcune sostanze chimiche e antibiotici sui microrganismi. Alcune sostanze inibiscono la crescita di alcuni microrganismi e non hanno alcun effetto su altri. Ad esempio, piccole concentrazioni di penicillina inibiscono la crescita di microrganismi gram-positivi e non influenzano quelli gram-negativi. Una miscela di penicillina e streptomicina permette di liberare funghi filamentosi e lieviti dalla flora batterica. L'acido solforico (soluzione al 5%) uccide rapidamente la maggior parte dei microrganismi e il bacillo della tubercolosi sopravvive in queste condizioni. È necessario tenere conto del fatto che i fattori selettivi sono spesso inclusi nel terreno in concentrazioni batteriostatiche, quindi i microrganismi associati rimangono vitali e quando si trasferiscono le colonie della coltura in studio su terreni convenzionali, possono essere la ragione per ottenere una coltura mista.
Una coltura pura è una raccolta di microrganismi appartenenti alla stessa specie. L'ottenimento di questo materiale è un punto di ricerca necessario nell'implementazione delle tecniche diagnostiche di laboratorio. Per isolare colture pure di batteri, vengono utilizzati strisci di sangue, espettorato, feci e viene esaminato materiale purulento e altro materiale biologico. In condizioni naturali (aria, acqua, suolo), prodotti alimentari e cadaveri (umani, animali) esistono associazioni di vari tipi di microrganismi.
La separazione della coltura pura è importante per uno studio dettagliato delle proprietà dei microbi: morfologici, culturali, biochimici e anche antigenici. Sulla base dei risultati di questi metodi di ricerca è possibile stabilire l'appartenenza dell'agente patogeno ad una determinata specie e tipo, in altre parole, effettuarne l'identificazione.
I principi della separazione biologica dei batteri implicano la presa in considerazione delle caratteristiche dell'attività vitale dei microbi al fine di selezionare i metodi di ricerca più ottimali. I metodi selezionati devono corrispondere all'agente patogeno secondo determinati parametri.
- Tipo di respirazione. Tra i batteri si distinguono gruppi di rappresentanti aerobici e anaerobici. Per ottenere microbi anaerobici, il materiale per la ricerca viene riscaldato. La fase successiva è la coltivazione del microbo in condizioni anaerobiche. I metodi per ottenere batteri aerobici e anaerobici sono diversi.
- Sporulazione. La capacità di alcuni batteri di formare spore fornisce protezione e preservazione dei microrganismi.
- Resistenza dei batteri agli effetti aggressivi di alcali e acidi. La resistenza di alcuni tipi di batteri a queste sostanze garantisce la massima purificazione del materiale di prova dalle impurità di altri batteri utilizzando soluzioni alcaline o acide.
- Motilità degli organismi batterici. Per separare una coltura pura di microrganismi mobili, vengono utilizzati metodi per separare le colture microbiche in una goccia di condensato.
- La sensibilità dei microrganismi agli antibiotici, ad alcuni prodotti chimici e ad altri agenti antimicrobici. Per alcuni agenti patogeni, i metodi più preferibili per isolare le colture utilizzano terreni nutritivi selettivi (specifici).
- Antibiotici. Pulire il materiale da ulteriori microrganismi.
- La capacità dei batteri di penetrare nella pelle intatta. Questa proprietà è inerente ad alcune varietà che presentano fattori di aggressività.
- Sensibilità degli animali ad alcune malattie di origine infettiva.
Tecniche di valutazione dei patogeni
Vengono utilizzati numerosi metodi per ottenere colture pure di cellule batteriche. Ognuno di essi viene utilizzato in una situazione particolare e presenta fasi successive e chiare per ottenere colonie dell'agente patogeno. Diamo un'occhiata a quelli più popolari.
La tecnica di Pasteur
Rappresenta la diluizione di colture pure in un terreno per la crescita batterica (consistenza liquida) per ottenere una concentrazione di 1 cellula per volume di liquido. Questo metodo di isolamento ha un grande significato storico.
Tecnica Koch
Conosciuta anche come tecnica del “cablaggio a piastra”. Si tratta di una diluizione del materiale per ricerca in agar (allo stato fuso alla temperatura di 48-50°C). Successivamente, la composizione risultante viene versata in piastre Petri, dove dovrebbe indurirsi.
Le vaccinazioni vengono solitamente eseguite dalle ultime 3-4 diluizioni, poiché lì sono già presenti pochi batteri. Pertanto, quando i microbi crescono su un mezzo nutritivo, compaiono colonie isolate di microrganismi che nascono da un'unica cellula madre. Quindi puoi selezionare una colonia isolata dalle profondità dell'agar e trasferirla in un mezzo nutritivo fresco. La fase successiva è l'identificazione e l'isolamento dell'agente patogeno.
La tecnica di Shukevich
Viene utilizzato quando è necessario isolare una coltura pura di Proteus aerobi o qualsiasi altro microbi caratterizzato da crescita “strisciante”. Seminare le colture sull'acqua condensata alla base del pendio dell'agar.
Con questo metodo di separazione di una coltura pura, gli organismi cellulari mobili (Proteus) salgono in cima al pendio dell'agar e le forme immobili non cambiano la loro posizione sul mezzo di inoculazione. Riseminando i bordi superiori della coltura germinata si può ottenere una coltura batterica pura.
La tecnica di Drigalsky
Il metodo Drigalski è abbastanza ampiamente utilizzato nello studio del materiale biologico diluendo le colture in una provetta con brodo o soluzione salina.
Passaggio successivo: una goccia della soluzione risultante viene distribuita uniformemente sulla superficie del mezzo alimentare nella prima tazza utilizzando una spatola di vetro sterile. Quindi, senza bruciare la spatola sul fuoco, lo seminano nella 2a e 3a ciotola. L'essenza del metodo Drygalsky è che con ogni successiva semina di colture la concentrazione di batteri (aerobi) diventa sempre meno. Sulla 3a piastra sono distribuite in modo abbastanza separato, ciascuna cellula batterica dà origine a cellule clonali (sotto forma di colonia isolata). Vengono sottoposti a subcoltura su slant di agar per accumulare agenti patogeni.
Tecnica Weinberg
L'isolamento di colture pure di agenti patogeni anaerobici causa alcune difficoltà se i microrganismi non muoiono a contatto con le molecole di ossigeno. L'essenza della tecnica è quella di rimuovere i microbi anaerobici (nel materiale) in un mezzo alimentare fuso leggermente raffreddato (45-50°C) (agarosato). Si effettuano 6-10 diluizioni. Poi arriva il passo successivo: è necessario raffreddare rapidamente la composizione nella provetta e riempire la sua superficie con una miscela di vaselina e olio di paraffina, che impedisce la penetrazione dell'aria e favorisce lo sviluppo di condizioni anaerobiche.
Se la semina è favorevole, il secondo giorno germinano colonie isolate, che possono essere rimosse dalla provetta riscaldandola con un bruciatore. Dalla colonna di agar tagliata, le colture vengono raccolte utilizzando un circuito per ulteriori ricerche. Le colonie risultanti vengono poste in un mezzo nutriente liquido, a quel punto possono essere completate le fasi di isolamento di una colonia di agenti patogeni anaerobici.
Tecnica dell'Hungate
Viene spesso utilizzato per isolare i microbi aerobici altamente sensibili all'ossigeno. Per effettuare questo isolamento della coltura aerobia, viene utilizzata la tecnica delle provette rotanti.
I metodi per inoculare i batteri aerobici prevedono la loro riproduzione su un mezzo di agar fuso. La presenza di un gas inerte in una provetta permette di coltivare colonne isolate di batteri aerobici in modo tale che le colture aerobiche isolate possano essere chiaramente viste anche ad occhio nudo per 2-3 giorni.
Micromanipolatore
Questa è una tecnica per isolare singole cellule batteriche utilizzando un micromanipolatore. Un micromanipolatore è un dispositivo speciale che può essere utilizzato per catturare una cellula da una sospensione e fornire anche la possibilità di inoculare la coltura in una provetta.
Un'ulteriore identificazione dell'agente patogeno viene effettuata tenendo conto di tutte le proprietà elencate dell'agente patogeno (aerobi e anaerobi), nonché delle caratteristiche della loro interazione con varie sostanze.
In una serie di diluizioni successive decuplicate del campione in esame dalle ultime 2 diluizioni (il grado di diluizione dipende dal numero di CFU in 1 dose del farmaco in esame), 0,1 ml della sospensione microbica vengono seminati su piastre Petri con una sostanza nutritiva medio (2 tazze per ogni diluizione). La sospensione viene distribuita uniformemente sulla superficie del terreno utilizzando una spatola Drigalski o perle di vetro fino a completo assorbimento (asciutta). Le piastre vengono coperte e poste capovolte in un forno di incubazione.
Le colture vengono incubate ad una temperatura di (37 1) o C per 24–96 ore in condizioni adeguate, a seconda del tipo di microrganismo (aerobico, microaerofilo o anaerobico). Durante l'incubazione in condizioni anaerobiche o microaerofile, le piastre Petri con i raccolti vengono collocate in un anaerostato e viene creata l'atmosfera gassosa necessaria.
Questo metodo può essere utilizzato per determinare il numero di batteri vivi di ciascuna specie nei probiotici multicomponente, a condizione che i batteri inclusi nella preparazione formino colonie visivamente distinguibili per forma e altre caratteristiche.
1.2. Metodo della tazza profonda
In una serie di diluizioni successive decuplicate del campione in esame dalle ultime 2 diluizioni (il grado di diluizione dipende dal numero di CFU nella preparazione del test), 1,0 ml di sospensione microbica viene aggiunto in piastre Petri con un diametro di 90 mm utilizzando una pipetta sterile della capacità di 1,0 ml (2 tazze per ogni diluizione). Aggiungere 20–25 ml di terreno nutritivo agar fuso e raffreddato ad una temperatura di 42,5 ± 2,5 o C, chiudere e mescolare rapidamente e accuratamente con movimenti rotatori e traslatori, senza sollevare il fondo della tazza dalla superficie del tavolo e impedire che il terreno penetri sul coperchio della tazza. Dopo che l'agar si è solidificato, le piastre Petri vengono capovolte e incubate in condizioni adeguate ad una temperatura di (37 1) o C per il tempo richiesto dal dato microrganismo.
Contabilità dei risultati
Al termine dell'incubazione, vengono contate le colonie cresciute sulle piastre Petri e viene calcolato il contenuto di batteri vivi in 1 dose del campione da testare. Nel conteggio sono state prese in considerazione le piastre su cui sono cresciute almeno 15 colonie.
Esempio di calcolo contenuto di cellule microbiche viventi in 1 dose del campione di prova:
– da una diluizione di 10 -7, sono cresciute 42 e 45 colonie; la media aritmetica è (42+45): 2 = 43,5;
– da una diluizione di 10 -6, sono cresciute 410 e 450 colonie; la media aritmetica è (410+450): 2 = 430;
– il numero di batteri vivi in 1 dose è pari a:
(43,5 ∙ 10 7 + 430 ∙ 10 6) : 2 10 = 4325000000 = 4,3 ∙ 10 9 .
Moltiplicare la media aritmetica del numero di colonie per il grado di diluizione e, se la semina su una piastra Petri viene eseguita in un volume di 0,1 ml, moltiplicare per un fattore 10 per convertire a 1,0 ml.
Metodo di limitazione delle diluizioni seguito dalla semina su terreni nutritivi liquidi e semiliquidi
Metodo in provetta dei numeri più probabili (per determinare il numero di lattobacilli acidofili viventi)
In una serie di diluizioni successive decuplicate del campione in esame 10 -6, 10 -7, 10 -8, 10 -9 (il grado di diluizione dipende dal numero di CFU nel campione in esame), 1 ml di sospensione microbica da ciascuna diluizione viene inoculata in 2 provette con 9 ml di latte sterile senza grassi. Si annota da quale diluizione è stato ottenuto il raccolto. Una diluizione 10 -6 del farmaco in una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% corrisponde ad una diluizione 10 -6 nel latte. Per controllare il terreno, aggiungere 4 provette non inoculate con latte. Le provette inoculate e di controllo vengono incubate a una temperatura di (38 ± 1) 0 C per 3–4 giorni.
Al termine dell'incubazione viene determinato il numero di provette con latte cagliato. Gli strisci vengono preparati dal coagulo in coltura e colorati con Gram. Se negli strisci sono visibili batteri caratteristici e non è presente microflora estranea, questa diluizione viene presa in considerazione come contenente microrganismi di questo tipo. In caso di fermentazione del latte nelle provette di controllo e se negli strisci viene rilevata microflora estranea, il controllo viene effettuato su un nuovo lotto di terreno.
Contabilità dei risultati
Quando si calcola il numero di individui viventi, utilizzare la tabella McCready (Tabella 1). Innanzitutto, viene compilata una caratteristica numerica. È composto da 3 numeri: al primo posto (a sinistra) mettere un numero pari al numero di provette con latte cagliato prelevate nell'ultima diluizione in cui il latte è stato cagliato in tutte le provette (ad esempio 2 provette di diluizione 10 -6).
I due numeri successivi indicano il numero di provette con latte cagliato in 2 diluizioni successive (ad esempio, in 1 provetta di diluizione 10 -7 e in 1 provetta di diluizione 10 -8).
La caratteristica numerica del risultato sarà 211.
Utilizzando la tabella McCready, trova il numero probabile corrispondente alla caratteristica digitale ottenuta (nel nostro caso, 13), moltiplicalo per la diluizione, che corrisponde alla prima cifra della caratteristica numerica (in questo esempio, 10 -6). Quindi il numero di microrganismi viventi in 1 dose è 13 ∙ 10 6 = 1,3 ∙ 10 7.
Tabella 1 - Tabella McCready utilizzata per il calcolo del numero di lattobacilli acidofili vivi
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Caratteristica numerica |
Il numero più probabile di microrganismi quando inoculati in 2 provette parallele |
77288 0
Proprietà culturali dei batteri
Le proprietà culturali (o macromorfologiche) includono caratteristiche della crescita di microrganismi su mezzi nutritivi solidi e liquidi. Sulla superficie di terreni nutritivi densi, a seconda della semina, i microrganismi possono crescere sotto forma di colonie, strisce o prato continuo.Una colonia è un insieme isolato di cellule dello stesso tipo cresciute da una cellula (clone di cellule). A seconda di dove cresce il microrganismo (sulla superficie di un mezzo nutritivo denso o nel suo spessore), si distinguono le colonie superficiali, profonde e inferiori.
Le colonie cresciute sulla superficie del terreno sono diverse: sono specie-specifiche e il loro studio viene utilizzato per determinare la specie della coltura in esame.
Quando si descrivono le colonie, vengono prese in considerazione le seguenti caratteristiche:
1) la forma della colonia: rotonda, ameboide, rizoide, irregolare, ecc.;
2) dimensione (diametro) della colonia: molto piccola (appuntita) (0,1-0,5 mm), piccola (0,5-3 mm), media (3-5 mm) e grande (più di 5 mm di diametro);
3) la superficie della colonia è liscia, ruvida, piegata, rugosa, con cerchi concentrici o striata radialmente;
4) profilo della colonia: piatto, convesso, a forma di cono, a forma di cratere, ecc.;
5) trasparenza: opaca, opaca, lucida, trasparente, polverosa;
6) colore della colonia (pigmento) - incolore o pigmentato (bianco, giallo, dorato, rosso, nero), in particolare notare il rilascio del pigmento nel mezzo con la sua colorazione;
7) bordo della colonia: liscio, ondulato, frastagliato, frangiato, ecc.;
8) struttura della colonia: omogenea, a grana fine o grossolana, striata; il bordo e la struttura della colonia vengono determinati utilizzando una lente d'ingrandimento o un microscopio a basso ingrandimento posizionando una piastra Petri con l'inoculazione sul tavolo del microscopio con il coperchio abbassato;
9) consistenza della colonia; determinato toccando la superficie con un'ansa: la colonia può essere densa, morbida, crescente in agar, mucosa (si estende dietro l'ansa), fragile (si rompe facilmente a contatto con l'ansa).
Le colonie profonde molto spesso assomigliano a lenticchie più o meno appiattite (forma ovale con estremità appuntite), a volte grumi di cotone idrofilo con escrescenze filiformi nel mezzo nutritivo. La formazione di colonie profonde è spesso accompagnata dalla rottura del mezzo denso se i microrganismi rilasciano gas.
Le colonie sul fondo solitamente appaiono come sottili pellicole trasparenti che si estendono lungo il fondo.
Le caratteristiche della colonia possono cambiare con l'età; dipendono dalla composizione del terreno e dalla temperatura di coltivazione.
La crescita dei microrganismi su terreni nutritivi liquidi viene presa in considerazione utilizzando colture da quattro a sette giorni coltivate in condizioni stazionarie.
Nei mezzi nutritivi liquidi, con la crescita di microrganismi, si osserva torbidità del mezzo e formazione di una pellicola o sedimento.
Quando si cresce su terreni nutritivi semiliquidi (0,5-0,7% di agar), i microbi mobili causano una torbidità pronunciata, le forme immobili crescono solo durante la semina mediante iniezione nel terreno.
Spesso la crescita dei microbi è accompagnata dalla comparsa di odori, pigmentazione dell'ambiente e rilascio di gas. L'odore caratteristico delle colture di alcuni tipi di batteri è associato alla formazione di vari esteri (acetato di etile, acetato di amile, ecc.), Indolo, mercaptano, idrogeno solforato, scatolo, ammoniaca, acido butirrico.
La capacità di formare pigmenti è inerente a molti tipi di microrganismi. La natura chimica dei pigmenti è varia: carotenoidi, antociani, melanine. Se il pigmento è insolubile in acqua, si colora solo la placca culturale; se è solubile, anche il mezzo nutritivo diventa colorato. Si ritiene che i pigmenti proteggano i batteri dagli effetti nocivi della luce solare, motivo per cui nell'aria sono presenti così tanti batteri pigmentati, inoltre i pigmenti sono coinvolti nel metabolismo di questi microrganismi;
In natura esistono i cosiddetti batteri fosforescenti, le cui colture brillano nell'oscurità con una luce verdastra-bluastra o giallastra. Tali batteri si trovano principalmente nell'acqua del fiume o del mare. I batteri luminosi - i fotobatteri - includono batteri aerobici (vibrioni, cocchi, bastoncelli).
Isolamento di colture pure di microrganismi
Una coltura pura è una coltura che contiene microrganismi della stessa specie. L'isolamento di colture pure di batteri è una fase obbligatoria della ricerca batteriologica nella pratica di laboratorio, nello studio della contaminazione microbica di vari oggetti ambientali e in generale in qualsiasi lavoro con microrganismi.Il materiale in esame (acqua, suolo, aria, cibo o altri oggetti) contiene solitamente associazioni di microbi.
L'isolamento di una coltura pura consente di studiare le caratteristiche morfologiche, culturali, biochimiche, antigeniche e di altro tipo, la cui totalità determina la specie e il tipo dell'agente patogeno, ovvero la sua identificazione.
Per isolare colture pure di microrganismi vengono utilizzati metodi che possono essere suddivisi in diversi gruppi:
1. Metodo Pasteur: diluizione sequenziale del materiale di prova in un mezzo nutriente liquido alla concentrazione di una cellula nel volume (ha un significato storico).
2. Metodo Koch ("collegamento della piastra") - diluizione sequenziale del materiale di prova in agar fuso (temperatura 48-50 C), seguita dal versamento in piastre Petri, dove l'agar si solidifica. Le inoculazioni vengono effettuate, di regola, dalle ultime tre o quattro diluizioni, dove i batteri diventano pochi e successivamente, man mano che crescono sulle piastre Petri, compaiono colonie isolate, formate da una cellula madre iniziale. Dalle colonie isolate nelle profondità dell'agar si ottiene una coltura pura di batteri mediante subcoltura su terreno fresco.
3. Metodo Shukevich - utilizzato per ottenere una coltura pura di Proteus e altri microrganismi con crescita "strisciante". Il materiale da testare viene inoculato nell'acqua di condensa alla base dello slant dell'agar. I microbi mobili (Proteus) sono in grado di sollevarsi sull'agar inclinato, le forme immobili rimangono per crescere più in basso, nel luogo della semina. Riseminando i bordi superiori della coltura, puoi ottenere una coltura pura.
4. Metodo Drigalsky - ampiamente utilizzato nella pratica batteriologica, in cui il materiale studiato viene diluito in una provetta con soluzione salina sterile o brodo. Una goccia di materiale viene aggiunta alla prima coppetta e distribuita sulla superficie del terreno utilizzando una spatola di vetro sterile. Poi, con la stessa spatola (senza bruciarla nella fiamma del bruciatore), si effettua la stessa semina nella seconda e nella terza tazza.
Ad ogni inoculazione di batteri, sulla spatola rimane sempre meno e, durante la semina nella terza tazza, i batteri verranno distribuiti sulla superficie del mezzo nutritivo separatamente gli uni dagli altri. Dopo 1-7 giorni di conservazione delle piastre in termostato (a seconda della velocità di crescita dei microrganismi), sulla terza piastra ogni batterio produce un clone di cellule, formando una colonia isolata, che viene subcoltivata su agar inclinato per accumularsi una cultura pura.
5. Metodo Weinberg. Particolari difficoltà sorgono quando si isolano colture pure di anaerobi obbligati. Se il contatto con l'ossigeno molecolare non provoca immediatamente la morte cellulare, la semina viene eseguita secondo il metodo Drigalsky, ma successivamente le piastre vengono immediatamente poste in un anaerostato. Tuttavia, il metodo di allevamento viene utilizzato più spesso. La sua essenza sta nel fatto che la diluizione del materiale in esame viene effettuata in un mezzo nutritivo agar fuso e raffreddato a 45-50 oC.
Si effettuano 6-10 diluizioni successive, quindi il mezzo nelle provette viene rapidamente raffreddato e la superficie viene ricoperta con uno strato di una miscela di paraffina e vaselina per impedire all'aria di penetrare nello spessore del mezzo nutritivo. A volte il mezzo nutritivo, dopo la semina e la miscelazione, viene trasferito in provette Burri sterili o pipette Pasteur capillari, le cui estremità sono sigillate. Con una diluizione riuscita, colonie isolate di anaerobi crescono nelle provette, nelle provette Burri e nelle pipette Pasteur. Per garantire che le colonie isolate siano chiaramente visibili, vengono utilizzati terreni nutritivi chiarificati.
Per estrarre colonie isolate di anaerobi, la provetta viene leggermente riscaldata facendola ruotare su una fiamma, mentre l'agar adiacente alle pareti si scioglie e il contenuto della provetta sotto forma di colonna di agar scivola in una capsula Petri sterile. La colonna di agar viene tagliata con una pinzetta sterile e le colonie vengono rimosse con un'ansa. Le colonie estratte vengono poste in un terreno liquido favorevole allo sviluppo dei microrganismi isolati. Il terreno agar viene espulso dal tubo Burri facendo passare il gas attraverso un tampone di cotone.
6. Metodo ungato. Quando si vogliono ottenere colonie isolate di batteri con sensibilità particolarmente elevata all'ossigeno (aerobi stretti), viene utilizzato il metodo del tubo rotante Hungate. Per fare ciò, il mezzo di agar fuso viene inoculato con batteri a corrente costante attraverso una provetta di gas inerte liberato dalle impurità di ossigeno. Il tubo viene poi sigillato con un tappo di gomma e posto orizzontalmente in una fascetta che fa ruotare il tubo; il mezzo si distribuisce uniformemente sulle pareti della provetta e si solidifica in uno strato sottile. L'utilizzo di uno strato sottile in una provetta riempita con una miscela di gas permette di ottenere colonie isolate e ben visibili ad occhio nudo.
7. Isolamento di singole cellule mediante un micromanipolatore. Un micromanipolatore è un dispositivo che consente di rimuovere una cellula da una sospensione utilizzando una speciale micropipetta o microloop. Questa operazione è controllata al microscopio. Sul tavolino del microscopio è installata una camera umida nella quale viene posizionata la preparazione delle gocce sospese. Le micropipette (micropoops) sono fissate nei supporti dei supporti operatori, il cui movimento nel campo visivo del microscopio viene effettuato con precisione micrometrica grazie ad un sistema di viti e leve. Il ricercatore, guardando al microscopio, preleva le singole cellule con micropipette e le trasferisce in provette contenenti un mezzo liquido sterile per ottenere un clone cellulare.
L.V. Timoschenko, M.V. Chubik
Ambienti speciali.
In batteriologia sono ampiamente utilizzati terreni nutritivi secchi prodotti industrialmente, che sono polveri igroscopiche contenenti tutti i componenti del terreno tranne l'acqua. Per la loro preparazione vengono utilizzati digeriti triptici di prodotti non alimentari economici (scarti di pesce, farina di carne e ossa, caseina tecnica). Sono convenienti per il trasporto, possono essere conservati a lungo, sollevano i laboratori dall'enorme processo di preparazione dei media e li avvicinano alla risoluzione del problema della standardizzazione dei media. L'industria medica produce terreni secchi Endo, Levin, Ploskirev, agar solfito di bismuto, agar nutriente, carboidrati con indicatore BP e altri.
Termostati
I termostati vengono utilizzati per coltivare microrganismi.
Un termostato è un dispositivo che mantiene una temperatura costante. Il dispositivo è costituito da un riscaldatore, una camera, doppie pareti, tra le quali circola aria o acqua. La temperatura è regolata da un termostato. La temperatura ottimale per la riproduzione della maggior parte dei microrganismi è di 37°C.
LEZIONE 7
ARGOMENTO: METODI PER ISOLARE COLTURE PURE DI AEROBI. FASI DI ISOLAMENTO DI COLTURE PURE DI BATTERI AEROBICI MEDIANTE IL METODO DI DISSOCIAZIONE MECCANICA
Piano di lezione
1. Il concetto di “coltura pura” di batteri
2. Metodi per isolare colture pure mediante separazione meccanica
3. Metodi biologici per l'isolamento di colture pure
4. Metodi per identificare i batteri
Scopo della lezione: Far conoscere agli studenti i vari metodi per isolare le colture pure, insegnare come seminare con un cappio, colpi e un'iniezione
Linee guida per la manifestazione
Nel loro habitat naturale, i batteri si trovano in associazioni. Per determinare le proprietà dei microbi e il loro ruolo nello sviluppo del processo patologico, è necessario disporre di batteri sotto forma di popolazioni omogenee (colture pure). Una coltura pura è una raccolta di individui batterici della stessa specie coltivati su un mezzo nutritivo.
Metodi per isolare colture pure di batteri aerobici
Metodo Pasteur Metodo Koch Biologico Fisico
(ha storico (cablaggio a piastra)
Senso)
Metodo chimico
Shchukevich
Moderno
Semina con ansa Semina con spatola
(Metodo Drigalski)
Metodi per isolare colture pure:
1. I metodi di separazione meccanica si basano sulla separazione dei microbi mediante sfregamento sequenziale del materiale di prova sulla superficie dell'agar.
a) Il metodo Pasteur - ha un significato storico, prevede la diluizione sequenziale del materiale di prova in un mezzo nutritivo liquido mediante il metodo di rotolamento
b) Il metodo di Koch - il metodo su piastra - si basa sulla diluizione sequenziale del materiale di prova con agar carne peptone, seguita dal versamento delle provette con il materiale diluito in piastre Petri.
c) Metodo Drygalsky - quando si semina materiale ricco di microflora, utilizzare 2-3 tazze per la semina sequenziale con una spatola.
d) Semina con ansa a falcate parallele.
2. I metodi biologici si basano sulle proprietà biologiche dei patogeni.
a) Biologico: infezione di animali altamente sensibili, dove i microbi si moltiplicano e si accumulano rapidamente. In alcuni casi, questo metodo è l'unico che permette di isolare la coltura dell'agente patogeno da un malato (ad esempio, affetto da tularemia), in altri casi è più sensibile (ad esempio, l'isolamento del pneumococco nei topi bianchi o il patogeno della tubercolosi nelle cavie).
b) Chimico – basato sulla resistenza agli acidi dei micobatteri. Per liberare il materiale dalla flora che lo accompagna, esso
trattato con soluzione acida. Cresceranno solo i bacilli della tubercolosi, poiché i microbi resistenti agli acidi muoiono sotto l'influenza dell'acido.
c) Il metodo fisico si basa sulla resistenza delle spore al calore. Per isolare una coltura di batteri sporigeni da
miscele, il materiale viene riscaldato a 80°C e inoculato su un mezzo nutritivo. Cresceranno solo i batteri sporali, poiché le loro spore sono rimaste vive e hanno dato origine alla crescita.
d) Metodo di Shchukevich - basato sull'elevata mobilità del Proteus vulgaris, in grado di produrre una crescita strisciante.
Metodo per la preparazione dell'agar in piastra
L'MPA viene sciolto a bagnomaria, quindi raffreddato a 50-55°C. Il collo della bottiglia viene bruciato alla fiamma di una lampada ad alcool, le piastre Petri vengono aperte in modo che il collo della bottiglia si inserisca senza toccare i bordi della piastra, si versano 10-15 ml di MPA, il coperchio viene chiuso, il piatto viene agitato in modo che il mezzo sia distribuito uniformemente e lasciato su una superficie orizzontale finché non si indurisce. Dopo l'essiccazione, le piastre di agar vengono conservate al freddo.
Semina ad anello
Utilizzando un'ansa sterile raffreddata, prendere una goccia di materiale, aprire un bordo della coppetta con la mano sinistra, portare l'ansa all'interno e fare alcuni colpi in un punto con un'ansa sul bordo opposto, quindi strappare l'ansa e inoculare il materiale in tratti paralleli da un bordo all'altro della tazza con un intervallo di 5-6 mm. All'inizio della semina, quando ci sono molti microbi nell'ansa, daranno una crescita confluente, ma ad ogni colpo ci sono sempre meno microbi nell'ansa, e rimarranno solitari e produrranno colonie isolate.
Semina secondo il metodo Drigalsky
Questo metodo viene utilizzato quando si inocula materiale fortemente contaminato dalla microflora (pus, feci, espettorato). Per seminare con il metodo Drigalsky, prendi una spatola e diverse tazze (3-4). Una spatola è uno strumento fatto di filo metallico o dardo di vetro, piegato a triangolo o a forma di L. Il materiale viene introdotto nella prima tazza con un'ansa o una pipetta e distribuito uniformemente con una spatola sulla superficie del mezzo, con la stessa spatola, senza bruciarlo, il materiale viene strofinato nel mezzo nutritivo nella seconda tazza, quindi nel terzo. Con tale semina, la prima tazza avrà una crescita confluente e nelle tazze successive cresceranno colonie isolate.