Antonova O.P., Malyugin B.E.

Penggunaan aktivator plasminogen jaringan rekombinan dalam pengobatan uveitis fibrinosa setelah keratoplasti dan operasi katarak secara simultan (kasus klinis)

1 Pusat Penelitian Medis Nasional "MNTK "Bedah Mikro Mata" dinamai demikian. acad. S.N. Fedorov" dari Kementerian Kesehatan Federasi Rusia

Uveitis fibrinosa merupakan salah satu komplikasi parah pasca operasi katarak dan keratoplasti. Kehadiran fibrin dalam jangka panjang di bilik mata depan mengubah dan memperburuk perjalanan periode pasca operasi. Terdapat bahaya efek toksik dan mekanis pada jaringan di sekitarnya, khususnya pada sel endotel cangkok, dan sinekia anterior yang timbul antara diafragma iridolentikular dan cangkok dapat menyebabkan pelepasan (cangkok). Adanya efusi fibrinosa di bilik mata depan memerlukan terapi kortikosteroid lokal dan sistemik yang intensif, yang pada gilirannya menunda proses rehabilitasi penglihatan, sementara pengobatan jangka panjang mungkin tidak memberikan hasil akhir yang diinginkan. Pembentukan membran pupil fibrinosa memperburuk hasil fungsional bahkan operasi yang dilakukan pada tingkat teknis tinggi dan menyebabkan perlunya intervensi berulang.

Obat utama dalam pengobatan uveitis fibrinosa adalah fibrinolitik dan aktivator plasminogen: fibrinolysin, streptodecase, urokinase, dll. Namun semua obat ini, kecuali urokinase, merupakan protein yang asing bagi tubuh manusia dan sering menimbulkan reaksi alergi. Selain itu, dalam dosis yang diperlukan untuk fibrinolisis aktif, obat ini bersifat toksik pada bagian dalam, dan dalam beberapa kasus, pada membran luar mata.

Salah satu obat terbaru dalam kelompok trombolitik pada bedah mata adalah aktivator plasminogen jaringan rekombinan (rTPA). rTPA adalah enzim alogenik. Analog alaminya ditemukan di hampir semua jaringan dan organ tubuh manusia, termasuk semua struktur mata. Oleh karena itu, enzim ini tidak memiliki sifat antigenik. Ciri khas rtPA adalah spesifisitasnya yang tinggi terhadap fibrin. Aktivasi plasminogen hanya terjadi pada permukaan substrat patologis (bekuan darah atau fibrin), sedangkan aktivasi fibrinolisis sistemik tidak terjadi bila menggunakan rtPA.

Enzim alteplase, yang mengandung aktivator plasminogen jaringan rekombinan, memiliki efek trombolitik yang nyata pada penyakit seperti infark miokard akut, tromboemboli arteri pulmonalis dan pembuluh darah otak. Ilmuwan asing pertama kali melaporkan hasil penggunaan rtPA dalam oftalmologi pada tahun 80an. abad terakhir. Ada sejumlah karya asing yang ditujukan untuk mempelajari pengaruh rtPA pada fibrinolisis intraokular dalam eksperimen dan data tentang penggunaan tunggalnya di klinik. Dalam literatur dalam negeri, publikasi pertama tentang masalah ini dimulai pada tahun 1995.

Sampai saat ini, banyak penelitian telah diterbitkan, terutama oleh peneliti asing, tentang penggunaan rtPA dalam pengobatan uveitis fibrinosa. Sejumlah penelitian telah meneliti efektivitas rtPA di berbagai patologi mata, metode pemberiannya, dosis tunggal dan dosis obat, kompatibilitasnya dengan metode tradisional perlakuan.

Dalam oftalmologi domestik modern, rtPA sangat jarang digunakan dalam pengobatan komplikasi pasca operasi, karena mahalnya harga obat, dan oleh karena itu bukan merupakan pilihan sehari-hari dalam memerangi uveitis fibrinosa.

Target- belajar sendiri contoh klinis efektivitas dan keamanan penggunaan aktivator plasminogen jaringan rekombinan dalam pengobatan uveitis fibrinosa pasca operasi.

Bahan dan metode

Kami memeriksa 1 pasien, 77 tahun, dengan diagnosis distrofi kornea endotel Fuchs yang dikombinasikan dengan katarak. Ketajaman penglihatan saat masuk adalah 0,05, keratopakimetri 650 µm pada titik pusat, kepadatan sel endotel tidak dapat ditentukan. Berdasarkan data di atas, diputuskan untuk melakukan operasi satu tahap: fakoemulsifikasi katarak dengan implantasi IOL bilik posterior dan keratoplasti lamelar otomatis posterior. Pada hari pertama periode pasca operasi, kornea transparan, lipatan tunggal membran Descemet, bilik mata depan memiliki kedalaman sedang, cairan bilik mata depan transparan, iris terstruktur, IOL berada di kantong kapsuler, di dalam posisi yang benar, PEC - 1340 sel/mm 2 . Selama empat hari pertama periode pasca operasi, kondisi mata tetap stabil. Terapi pada periode pasca operasi adalah standar dan termasuk pemberian antibiotik, kortikosteroid, obat antihipertensi, keratoprotektor, dan suntikan kortikosteroid subkonjungtiva. Pada hari kelima setelah operasi, biomikroskopi memvisualisasikan eksudat fibrinosa di bilik mata depan, yang merupakan membran pupil dengan sinekia anterior menempel pada tepi cangkok (Gbr. 1), dan oleh karena itu terapi di atas disesuaikan: frekuensi pemberian obat antibiotik dan kortikosteroid per hari ditingkatkan, pemberian midriatik, NSAID, dan pemberian kortikosteroid sistemik ditambahkan.

Terapi ini dilakukan selama 15 hari, namun tidak ada dinamika positifnya. Masalah intervensi bedah berulang untuk tujuan aspirasi efusi fibrin dari bilik mata depan ditolak karena tingginya risiko pelepasan cangkok. Diputuskan untuk menggunakan aktivator plasminogen jaringan rekombinan (Actilyse, Boehringer Ingelheim Pharma, Jerman). Pada hari ke 16 periode pasca operasi, rtPA disuntikkan ke bilik mata depan sebanyak 25 g/ml, 0,2 ml. Perhitungan dosis obat yang disajikan didasarkan pada hasil sejumlah karya peneliti asing.

hasil

Dinamika positif dicatat dalam beberapa jam berikutnya: 3 jam setelah pemberian obat, membran pupil berkurang setengahnya, sinekia anterior yang menempel pada tepi cangkok sama sekali tidak ada. 8 jam setelah pemberian rtPA, resorpsi hampir sempurna diamati, dan sejumlah kecil fibrin tertinggal di permukaan anterior IOL. Keesokan harinya, menurut data OCT Visante, membran pupil dipertahankan pada permukaan anterior IOL, yang dimensinya pada bidang sagital adalah 0,21-0,28 mm. Untuk menilai keadaan monolayer sel endotel cangkok setelah dimasukkannya rtPA ke dalam bilik mata depan, dilakukan penghitungan PEC yaitu 1290 sel/mm 2, ketajaman penglihatan - 0,3. Pada hari ke 7 setelah pemberian rtPA, selama biomikroskopi, membran fibrin diamati pada permukaan anterior IOL di tepi pupil iris; menurut OCT Visante, dimensi sisa fibrin adalah sebagai berikut: di bidang sagital - 0,09 mm, di bidang frontal - 0,54 mm. PEC - 1310 sel/mm 2, ketajaman penglihatan tetap stabil - 0,3. Setelah 1 bulan setelah pemberian rtPA, terjadi resolusi lengkap dari proses fibrinosa di bilik mata depan, PEC - 1280 sel/mm 2, ketajaman penglihatan - 0,4. Perlu dicatat bahwa sepanjang periode pasca operasi, yang disertai dengan terapi di atas dan pengenalan rtPA ke dalam bilik mata depan, cangkokan tetap transparan, padat, dan sepenuhnya berdekatan dengan lapisan posterior stroma penerima (Gbr. 2). 2).

kesimpulan

berdasarkan hal di atas kasus klinis, kita dapat menyimpulkan bahwa proses resorpsi fibrin di bilik mata depan dengan pemberian rtPA intrakameral tunggal dipercepat berkali-kali lipat. Dengan demikian, berdasarkan pengalaman klinis kami, kami dapat menyatakan bahwa penggunaan aktivator plasminogen jaringan rekombinan adalah alternatif yang aman dan efektif dalam menghilangkan membran fibrin pasca operasi. Tidak ada reaksi merugikan dan pengaruh negatif pada endotel kornea, resolusi lengkap dari proses fibrinosa di bawah pengaruh rtPA menghilangkan kebutuhan akan tindakan berulang. intervensi bedah, yang pada gilirannya mengurangi risiko dislokasi cangkok dan mempercepat rehabilitasi penglihatan pasien. Sayangnya, biayanya tinggi obat ini mengecualikan penggunaannya di klinik dalam banyak kasus.

Halaman sumber: 9

Komponen utama dari sistem fibrinolitik plasma. Aktivator plasminogen, ditinjau dari signifikansi fisiologis dan patofisiologisnya, dapat berasal dari alam (fisiologis) dan bakteri.

Aktivator plasminogen fisiologis

Mirip dengan sistem koagulasi, ada dua jalur aktivasi plasminogen - internal dan eksternal.

Mekanisme internal dipicu oleh faktor yang sama yang memulai pembekuan darah, yaitu faktor XIIa (faktor Hageman teraktivasi), yang berinteraksi dengan prekalikrein dan berat molekul tinggi kininogen plasma, mengaktifkan plasminogen.

Kontak plasma dengan permukaan asing melalui faktor XII, yang mengaktifkan pembekuan darah, sekaligus menyebabkan aktivasi fibrinolisis. Dalam hal ini, selama aktivasi faktor XII, proaktivator plasminogen plasma khusus, identik dengan prekallikrein (faktor Fletcher), diubah menjadi aktivator plasminogen, yang mengaktifkan plasminogen menjadi plasmin.

Ternyata di bawah pengaruh enzim proteolitik pada faktor XII, fragmen prealbumin terbentuk. Mereka, sebagai prokoagulan, kurang aktif dibandingkan faktor XII yang diaktifkan, tetapi memiliki dua jenis aktivitas lain: merangsang fibrinolisis dan pembentukan kinin. Fragmen faktor XII mengubah proaktivator menjadi aktivator plasminogen. Aktivasi langsung plasminogen disebabkan oleh kalikrein. Namun, biasanya tidak ada kalikrein bebas dalam darah manusia: ia dalam keadaan tidak aktif atau dalam kombinasi dengan inhibitor, oleh karena itu aktivasi plasminogen oleh kalikrein hanya mungkin terjadi jika terjadi peningkatan aktivitas sistem kinin yang signifikan.

Dengan demikian, jalur internal fibrinolisis memastikan aktivasi sistem plasmin bukan setelah pembekuan darah, tetapi bersamaan dengan itu. Ia bekerja dalam "siklus tertutup", karena bagian pertama kalikrein dan plasmin yang terbentuk mengalami proteolisis oleh faktor XII, membelah fragmen, di bawah pengaruh transformasi prekallikrein menjadi kalikrein meningkat.

Aktivasi Jalur Eksternal dilakukan terutama melalui aktivator plasminogen jaringan(TAP), yang disintesis dalam sel endotel yang melapisi pembuluh darah. Aktivator yang identik atau sangat mirip ditemukan di banyak jaringan dan cairan tubuh. Sekresi aktivator plasminogen jaringan dari sel endotel bersifat konstan dan meningkat di bawah pengaruh berbagai rangsangan: trombin, sejumlah hormon dan obat(adrenalin, vasopresin dan analognya, asam nikotinat), stres, syok, hipoksia jaringan, trauma bedah. Aktivator plasminogen dan plasminogen jaringan memiliki afinitas yang kuat terhadap fibrin. Ketika fibrin muncul, plasminogen dan aktivatornya berikatan dengannya untuk membentuk kompleks terner (aktivator plasminogen jaringan fibrin-plasminogen), yang semua komponennya diatur sedemikian rupa sehingga terjadi aktivasi plasminogen yang efektif. Akibatnya, plasmin terbentuk langsung pada permukaan fibrin; yang terakhir ini selanjutnya mengalami degradasi proteolitik.

Aktivator plasminogen alami kedua adalah urokinase, yang disintesis oleh epitel ginjal, yang, tidak seperti aktivator jaringan, tidak memiliki afinitas terhadap fibrin. Aktivasi plasminogen terjadi pada reseptor spesifik pada permukaan sel endotel dan sejumlah sel darah yang terlibat langsung dalam pembentukan bekuan darah. Biasanya, tingkat urokinase plasma beberapa kali lebih tinggi daripada tingkat aktivator plasminogen jaringan; Ada laporan tentang peran penting urokinase dalam penyembuhan endotel yang rusak.

Aktivator plasminogen jaringan dan urokinase saat ini disintesis dengan metode DNA rekombinan dan digunakan sebagai obat.

Aktivator bakteri fibrinolisis

Aktivator bakteri fibrinolisis termasuk streptokinase dan staphylokinase. Karena seseorang sering menderita penyakit streptokokus dan stafilokokus yang nyata atau tersembunyi sepanjang hidupnya, ada kemungkinan streptokinase dan stafilokinase memasuki darah.

Streptokinase– penggerak fibrinolisis spesifik yang kuat. Ini diproduksi oleh streptokokus hemolitik kelompok A, C.

Streptokinase adalah aktivator plasminogen tidak langsung. Ia bekerja pada proaktivator plasminogen, mengubahnya menjadi aktivator, yang mengaktifkan plasminogen menjadi plasmin.

Reaksi antara streptokinase dan proaktivator plasminogen berlangsung dalam dua tahap: tahap pertama, proaktivator II terbentuk dari proaktivator I, tahap kedua, proaktivator II diubah menjadi aktivator yang mengaktifkan plasminogen.

Invensi ini berkaitan dengan plasminogen aktif jaringan baru yang lebih baik (TPA yang ditingkatkan), yang memiliki waktu paruh lebih lama di dalam tubuh dan meningkatkan stabilitas terhadap panas dan asam, yang dapat digunakan untuk menekan peradangan di sekitar area trombosis. Invensi ini juga berhubungan dengan metode untuk memproduksi aktivator plasminogen jaringan tersebut dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan dan cara yang digunakan untuk penerapannya. Diketahui bahwa aktivator plasminogen jaringan manusia (TPA) memiliki aktivitas fibrinolitik yang bermanfaat dan sangat efektif melawan plasminogen yang terikat fibrin, namun tidak mengaktifkan plasminogen dalam fase sirkulasi bebas dalam tubuh seefektif agen trombolitik konvensional, streptokinase (SK) dan urokinase (Inggris). Urutan asam amino APT manusia dan urutan nukleotida cDNA yang mengkode APT manusia telah diketahui (Pennica. D., et al., Nature, 301, 214-221, 1983). APT manusia juga diketahui dapat melarutkan bekuan darah vena dan arteri. Dalam skala besar studi klinis mencatat bahwa APT manusia yang diberikan secara intravena efektif dalam reperfusi arteri koroner yang tersumbat pada pasien dengan serangan jantung akut miokardium. Namun, kelemahan penggunaan obat ini dalam pengobatan penyakit yang berhubungan dengan pembentukan trombus adalah waktu paruh aktivitas enzimatiknya yang sangat singkat dalam darah (Rijken, D.C., et al., Thromb. Heamost. 54 (1), 61, 1985, Hubert, EF, dkk., Blood, 65, 539, 1985). Ketika digunakan untuk pengobatan, APT manusia harus diberikan sebagai suntikan intravena dosis tinggi yang berkelanjutan. Diketahui bahwa APT manusia yang terjadi secara alami memiliki struktur domain, mulai dari ujung N molekul terdapat domain jari, domain EGF (faktor pertumbuhan epidermal), dua domain “kringle 1” dan “kringle 2” dan serin. domer protease. Dalam karya Rijken et al., dicatat (Rijken D.C., et al., Thromb. Heamost., 54 (1), 61, 1985) bahwa waktu paruh biologis APT manusia yang pendek mungkin terkait dengan semua domain APT manusia, kecuali untuk domain serin -protease. Karya Zonneveld dkk. (Zonneveld, A.J.V., dkk, Proc. Natl. Acad. USA., 83, 4670, 1986) juga mencatat bahwa domain jari, domain EFR, dan domain kringle 2 mungkin memiliki penting untuk aktivitas pengikatan fibrin pada APT manusia yang terjadi secara alami, serta untuk mempertahankan aktivasi APT yang bergantung pada fibrin. Namun, belum ada langkah khusus yang dikembangkan untuk mempertahankan aktivitas pengikatan fibrin dari APT manusia yang terjadi secara alami dan aktivitasnya yang bergantung pada fibrin, serta untuk memperpanjang waktu paruh biologis. Permohonan Paten Jepang yang Diterbitkan Laid-Open No. 48378/1987 menjelaskan suatu APT yang diperoleh dengan menghilangkan asam amino 87-175 dari APT manusia yang terjadi secara alami di mana "kringle 1" dihilangkan. APT ini dibedakan dengan mutasi titik terinduksi tambahan di wilayah faktor pertumbuhan epidermal. Permohonan paten Jepang mengungkapkan bahwa APT yang dimodifikasi memiliki kemampuan untuk berikatan dengan fibrin, namun interaksi dengan inhibitor aktivator plasminogen jaringan melemah. Paten Eropa No. 241208 menjelaskan suatu APT yang diperoleh dengan menghilangkan asam amino 92-179 dari APT manusia yang terjadi secara alami dimana Kringle 1 juga dihilangkan. Karya ini menyebutkan bahwa APT ini memiliki aktivitas fibrinolitik. Selain itu, Paten Eropa No. 231624 mengungkapkan suatu APT yang dimodifikasi mempunyai waktu paruh yang panjang. APT yang dimodifikasi, memiliki urutan F-EGFK2-A, tidak memiliki domain kringle 1, tetapi tidak ada metode khusus untuk pembuatannya yang ditunjukkan. Mengingat hal di atas, jelas bahwa APT yang dimodifikasi sesuai dengan penemuan ini harus berbeda dari APT yang terjadi secara alami dalam urutan asam amino di wilayah domain internal. Sebagai hasil dari penelitian ekstensif, pemohon telah memperoleh APT yang ditingkatkan, yang berisi domain jari, domain EFR, domain kringle 2, dan domain serine protease, tetapi domain “kringle 1” pertama dihapus di situs tertentu, dan di situs pengikatan domain, mutasi kringle 2 dan serin protease telah diperkenalkan, menghasilkan APT yang lebih baik yang menunjukkan ketahanan terhadap panas dan asam yang unggul, waktu paruh biologis yang sangat lama dan aktivitas anti-inflamasi yang signifikan, sambil mempertahankan sifat-sifat yang diinginkan dari APT manusia yang terjadi secara alami. Penemuan ini berhubungan dengan APT yang ditingkatkan. APT sesuai dengan penemuan ini sangat berbeda sifatnya struktur kimia dari APT manusia yang terjadi secara alami dan menunjukkan sifat-sifat unggul. APT yang ditingkatkan sesuai dengan penemuan ini adalah suatu polipeptida yang mempunyai urutan asam amino yang diwakili oleh rumus umum 28-29, dimana R adalah hubungan langsung, Y adalah A-Ile-B (A adalah Arg atau Glu dan B adalah lys atau Ile), sebaiknya Glu-Jle-Lys. H 2 N menunjukkan ujung amino dan -COOH menunjukkan ujung karboksi). Dalam penemuan ini, istilah "APT yang ditingkatkan" digunakan untuk merujuk pada analog APT, dimana A dan B masing-masing mewakili asam amino yang diuraikan di bawah ini:

Peningkatan APT (II): Arg, Lys;

APT Lanjutan (V): Arg, Ile;

APT Lanjutan (VI): Glu, Lys;

Peningkatan APT (VIII): Glu, Ile. Invensi ini juga diarahkan pada ekspresi analog APT yang diusulkan dengan menggunakan teknik DNA rekombinan. Terkait dengan ini adalah DNA baru yang mengkode APT yang ditingkatkan dan vektor ekspresi DNA rekombinan. Gambar 1, 2 menunjukkan urutan 16 oligodeoksinukleotida yang digunakan untuk membuat fragmen gen sintetik yang mengkode APT (II) yang ditingkatkan; pada Gambar 3 - 4 - sebuah fragmen gen sintetik untuk membangun APT (II) yang ditingkatkan dari penemuan ini, yang mengandung ujung enzim restriksi Bge 11 dan Eco R1, yang dibuat menggunakan 16 oligodeoksinukleotida yang ditunjukkan pada Gambar 1 - 2 ; Gambar 5 - metode untuk membangun APT (II) yang ditingkatkan (pada gambar, area hitam, area yang diarsir, dan area yang tidak diarsir masing-masing menunjukkan wilayah yang mengkode protein APT matang, wilayah yang mengkode propropeptida, dan wilayah yang tidak diterjemahkan; Gambar 6 - metode untuk menguji fragmen blok gen sintetik IV dengan menentukan urutan basa DNA menggunakan metode dideoksi dan metode 7-DEAZA; pada Gambar. 7 - metode untuk membangun vektor ekspresi pVY1 pada sel hewan dan integrasi DNA dari APT yang ditingkatkan dalam pVY1; pada Gambar. 8 - 13 urutan DNA yang mengkode APT yang ditingkatkan (II) dan APT yang ditingkatkan (V); Gambar 14 - 19 - urutan asam amino yang berasal dari urutan DNA yang mengkode APT yang ditingkatkan (II ) dan peningkatan APT (V); Gambar 20 - enzim restriksi dan peta fungsional plasmid pTPA 2 yang memiliki fragmen Eco R1-Xho (sekitar 1000 pasangan basa) dari gen APT alami, diintegrasikan ke dalam vektor pBR322 di Eco R1 dan Bam situs pembelahan H1; Gambar 21 - mp9 (peningkatan APT (II), memiliki fragmen gen BgL11-Xho 11 (sekitar 1500 pasangan basa), peningkatan APT (II) diintegrasikan ke dalam DNA untai ganda M13 mp9 di lokasi pembelahan BamH1; Gambar. 22 - ketergantungan " dosis-efek" untuk aktivitas APT dari APT (VI) yang ditingkatkan dan APT yang terjadi secara alami menggunakan metode S-2251 dengan ada (+Fb) dan tidak adanya (-Fb) substituen fibrin; 23 - perubahan aktivitas APT (VI) yang ditingkatkan dan APT asli dalam darah kelinci seiring waktu; Gambar 24 - perubahan aktivitas sisa APT (VI) yang ditingkatkan setelah perlakuan panas; faktor pengaktif limfosit (LAF) dengan peningkatan APT (VI); Gambar 26 - aktivasi dengan menggunakan protein terdenaturasi, peningkatan APT (VI); 27 - degradasi protein terdenaturasi di bawah pengaruh peningkatan APT (VI). Metode untuk memperoleh DNA rekombinan dan sel yang ditransformasikan dijelaskan secara rinci di bawah ini. Metode untuk mendapatkan peningkatan APT. Gen yang mengkode APT alami yang merupakan sumber APT penemuan ini diisolasi dari bank cDNA yang dibuat dari sel melanoma manusia Bowes. Poli A+ RNA diisolasi dari sel melanoma Bowes manusia dan difraksinasi dengan sentrifugasi gradien kepadatan sukrosa. Sejumlah kecil poli(A) + RNA terfraksinasi kemudian dipilih dan fraksi mRNA yang mengkode gen APT diidentifikasi dengan hibridisasi titik menggunakan probe oligonukleotida yang mampu mengenali urutan mRNA APT tertentu. Dengan menggunakan fraksi kaya APT mRNA sebagai bahan awal, bank cDNA disiapkan dan disaring menggunakan probe identifikasi APT mRNA yang dijelaskan di atas. Karena tidak ada satu pun klon yang memiliki urutan gen APT lengkap yang telah diisolasi, maka urutan basa yang hilang tersebut disintesis dengan penyintesis DNA untuk mendapatkan gen yang diinginkan. Gen yang diinginkan kemudian dibangun melalui induksi mutasi spesifik lokasi. Fragmen Eco R1-Xho 11 muncul secara alami pada gen APT (sekitar 1000 pasangan basa), sebagian dihapus pada ujung N =, dimasukkan ke dalam vektor pBR332 di lokasi pembelahan Eco R1 dan BamH1, menghasilkan pTPA2. Strain (E. coli HB 101/pTPA2), diperoleh dengan mentransformasikan E. coli dengan plasmid ini, disimpan di Lembaga Penelitian Fermentasi Badan Sains dan Teknologi Industri Jepang di bawah nomor pendaftaran P-9649 (FERM BP-2107). Pembatasan dan peta fungsional plasmid pTPA2 ditunjukkan pada Gambar 20. Gen APT yang ditingkatkan dimasukkan ke dalam plasmid pVY1. Plasmid pVY1 dibuat dengan mengikat fragmen BamH1-Kpn1 (sekitar 2900 pasangan basa) dari plasmid pRSV10 (diproduksi oleh Fine Chemicals) dengan fragmen dari pencernaan Eco R1 dari plasmid pAdD26SV (A) N 3 (N) (diperoleh dari Dr. Hiroshi Handa dari Universitas Tokyo (setelah menerima pada kedua ujungnya yang tumpul. Oleh karena itu, vektor ini mengandung gen cDNA dihidrofolat reduktase tikus di bawah kendali transkripsi dari promotor akhir utama adenovirus (Ad2), promotor awal SV 40 di bagian hulu dari situs penyisipan gen APT yang ditingkatkan dan urutan intron dan poliadenilasi yang terletak di bagian hilir gen. penemuan ini dapat dimasukkan ke dalam vektor ekspresi lain yang sesuai. Vektor ekspresi selanjutnya dimasukkan ke dalam sel inang yang sesuai untuk memperoleh sel prokariotik .coli, dapat digunakan sebagai sel inang. Bacillus subtilis dll., mikroorganisme eukariotik seperti ragi, dll., serta sel hewan tingkat tinggi. Sebagai perwakilan dari E. coli, biasanya digunakan strain JM109, strain W3110, Q, dll. milik strain K12, dan strain BD170, strain BR151, dll. digunakan sebagai perwakilan Bacillus subtilis. Dari ragi bisa menggunakan strain RH218, strain SHY1, dll. ragi Saccharomyces cerevisiae. Untuk ekspresi, biasanya digunakan vektor plasmid atau vektor fag, yang berisi replika yang berasal dari spesies yang kompatibel dengan sel inang dan urutan pengatur. Contoh vektor E. coli misalnya plasmid pBR322, pUC18, pUC19, dll, fag misalnya qt, Charon 4A, dll, fag M13, dll. pUB110 dapat digunakan sebagai vektor Bacillus subtilis , pSA2100, dll., dan YRp7, YEp61, dll. dapat digunakan sebagai vektor ragi. Vektor harus membawa promotor yang mampu mengekspresikan protein yang diinginkan. Sebagai promotor gen E. coli atau gen fag misalnya dapat digunakan Lae, trp, tac, trc, pL, dll. Sebagai inang, sel hewan yang dibudidayakan seperti sel ginjal monyet rhesus, sel jentik nyamuk, sel ginjal monyet hijau afrika, sel fibroblas janin tikus, sel ovarium hamster cina, sel ginjal janin manusia, sel jaringan telur kupu-kupu, sel mirip epitel serviks manusia dapat digunakan. sel, sel myeloma manusia, fibroblas tikus dan sebagainya. Sebagai vektor, Anda dapat menggunakan promotor awal SV40, promotor akhir SV40, SV40 yang membawa promotor dari gen eukariotik (misalnya, gen ovalbumin unggas yang diinduksi estrogen, gen interferon, gen tirosin aminotransferase yang diinduksi glukokortikoid, gen timidin kinase, gen awal dan gen adenovirus akhir, gen fosfogliserat kinase, gen -faktor, dll.), virus papiloma sapi atau vektor turunannya. Selain itu, diketahui bahwa APT yang disekresi dan diproduksi oleh sel memiliki N-termini yang berbeda bergantung pada perbedaan lokasi pembelahan. Dalam kasus sekresi dan produksi APT menggunakan sel kultur sebagai inang, metode pembelahan sinyal peptidase atau protease bervariasi tergantung pada jenis sel, sehingga dapat diperoleh spesies APT yang memiliki N-termini berbeda. Fenomena ini tidak hanya cocok untuk kasus sekresi dan produksi dengan menggunakan sel kultur, karena diyakini bahwa fenomena serupa juga dapat terjadi ketika memperoleh APT melalui E. coli, Bacillus sublitis, ragi dan sel lain yang mengalami modifikasi khusus. Untuk transformasi inang menggunakan vektor ekspresi dengan gen APT yang ditingkatkan terintegrasi ke dalamnya, dalam kasus E. coli, metode Hanahan, Hanahan, D.J.Mol dapat digunakan. Biol., 166, 557, 1983), dalam hal manipulasi sel hewan, metode kalsium fosfat dapat digunakan (Vander Eb, A.J. dan Graham, F.L., Method in Enrymoloqy, 65, 826, 1980, Academic Press) dan segera. Seperti dijelaskan di atas, peningkatan APT berguna untuk pengobatan berbagai penyakit yang didapat, termasuk pembekuan darah (bahkan vena dalam ), emboli paru, trombosis arteri perifer, emboli akibat kerusakan arteri jantung atau perifer, infark miokard akut, dan serangan trombotik. Seperti APT manusia yang terjadi secara alami, APT yang ditingkatkan ini sangat cocok untuk pengobatan infark miokard akut. APT manusia yang terjadi secara alami baru-baru ini terbukti efektif dalam melarutkan trombus yang menyumbat arteri koroner, meregenerasi perfusi miokard, dan memulihkan sebagian besar lapisan miokard iskemik bila diberikan secara intravena dengan dosis 30 hingga 70 mg selama 1 hingga 3 jam. APT yang ditingkatkan ini memiliki waktu paruh biologis yang panjang di dalam darah dan oleh karena itu efektif dalam kasus yang sama seperti APT manusia yang terjadi secara alami. Diharapkan bahwa APT yang ditingkatkan dapat menghasilkan efek klinis yang mirip dengan APT manusia yang terjadi secara alami dengan dosis sekitar 10% dari dosis yang direkomendasikan untuk APT manusia yang terjadi secara alami, bahkan ketika diberikan sebagai dosis tunggal. Selain itu, APT yang ditingkatkan dari penemuan ini memperlihatkan sifat-sifat berharga berikut, yang sampai sekarang tidak diketahui untuk APT manusia asli dan APT yang dimodifikasi. a) Aktivitas anti-inflamasi. Di lokasi trombus, tidak hanya pembentukan trombus itu sendiri yang terdeteksi, tetapi juga pembentukan produk degradasi fibrin atau sejumlah kecil kinin. Zat-zat tersebut diketahui memiliki aktivitas pemicu peradangan sehingga menyebabkan peradangan pada area trombus. Oleh karena itu, obat yang digunakan untuk mengobati trombosis diharapkan tidak hanya memiliki aktivitas trombolitik, tetapi juga aktivitas antiinflamasi. Sebagai hasil penelitian, pemohon mampu memberikan aktivitas anti-inflamasi pada APT yang ditingkatkan berdasarkan dua fungsi. Salah satunya adalah peningkatan APT yang menghambat aktivitas biologis interleukin 1 (IL-1), yang merupakan salah satu mediator respon inflamasi. IL-1 yang diproduksi oleh makrofag diduga ikut serta dalam respon inflamasi melalui hipertermia, percepatan pertumbuhan fibroblas, produksi kolagenase pada membran sel sinovial, dan sebagainya, atau dengan mempercepat sintesis prostasiklin pada sel endotel pembuluh darah. Diketahui juga bahwa IL-1 bekerja pada sel hati, mempercepat produksi protein (protein amiloid serum, fibrinogen, dll.). ) pada fase akut, yang meningkat seiring dengan peradangan. Pemohon telah menemukan bahwa peningkatan aktivitas penghambatan APT (aktivitas LAF) untuk meningkatkan reaktivitas mitogenik timosit tikus, yang merupakan salah satu aktivitas biologis IL-1. Fungsi lainnya adalah bahwa APT tingkat lanjut memiliki afinitas terhadap protein yang terdenaturasi (imunoglobulin G yang terdenaturasi, albumin yang terdenaturasi, dll.) akibat peradangan di lokasi trombus, dan selanjutnya memiliki sifat untuk diaktifkan oleh protein yang terdenaturasi ini. Berkat aktivitas ini, APT yang ditingkatkan hanya mendegradasi protein yang terdenaturasi di area peradangan, dan peradangan dapat diatasi untuk sementara. Pemohon dikonfirmasi oleh elektroforesis gel natrium dodesil sulfat bahwa APT yang ditingkatkan hanya mendegradasi protein yang terdenaturasi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 26, aktivasi dan selektivitas APT yang ditingkatkan oleh protein terdenaturasi terlihat jelas. Dengan imunoglobulin G yang diobati dengan HCl, dan pada konsentrasi beberapa kali lebih rendah, aktivitas yang sama ditunjukkan seperti fibrinogen yang diobati dengan BrCN. Di sisi lain, imunoglobulin C normal tidak menunjukkan efek pengaktifan pada peningkatan APT bahkan pada konsentrasi 500 μg/ml. Mencegah oklusi ulang setelah mengembalikan perfusi pada oklusi pembuluh darah . Diketahui bahwa ketika mengobati trombosis dengan APT alami, oklusi ulang diamati dengan frekuensi tinggi setelah pemulihan aliran darah ke pembuluh darah yang tersumbat. Untuk itu dilakukan terapi kombinasi dengan inhibitor koagulasi trombosit atau antikoagulan. Namun, terapi kombinasi melibatkan masalah interaksi obat, pengendalian dosis, efek serupa, dan sebagainya. Sebaiknya, APT itu sendiri juga mempunyai aktivitas pencegahan oklusi ulang. APT yang ditingkatkan dari penemuan ini mempunyai kemampuan untuk mencegah kejadian oklusi ulang melalui dua jenis aktivitas. Tipe pertama adalah pencegahan penurunan cepat konsentrasi APT setelah pengenalan APT yang ditingkatkan karena durasi kerja yang berkepanjangan, yang mengarah pada penghapusan tanda Stewart-Holmes dan dengan demikian mencegah terjadinya oklusi ulang. Tipe kedua adalah dengan mencegah kerusakan sel endotel vaskular yang diinduksi IL-1, koagulasi trombosit dihambat secara tidak langsung, sehingga mencegah kejadian oklusi ulang. c) Peningkatan stabilitas. Sediaan protein biasanya tidak stabil, sehingga disarankan untuk menyimpan sediaan dalam keadaan kering beku atau pada suhu rendah dalam bentuk larutan. Saat memberikan aktivator plasminogen kepada pasien dengan infark miokard akut, prosedur ini perlu dilakukan dalam beberapa jam setelah timbulnya serangan untuk mengurangi angka kematian. Dalam hal ini, sediaan stabil yang dapat disimpan pada suhu kamar diinginkan. Selain itu, peningkatan stabilitas memungkinkan dilakukannya perlakuan panas, perlakuan asam, dll. selama persiapan obat. Khususnya, sehubungan dengan peningkatan APT dari penemuan ini, yang dihasilkan melalui kultur sel, menjadi mungkin untuk menghilangkan retrovirus yang berasal dari sel, yang diketahui sensitif terhadap panas. Penemuan ini dijelaskan di bawah ini secara lebih spesifik dengan mengacu pada contoh-contoh, namun tidak terbatas pada contoh-contoh tersebut. Kecuali ditentukan lain, DNA rekombinan diproduksi sesuai pedoman laboratorium. Maniatis T dkk., Kloning Molekuler: Manual Laboratorium, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York (1982). Contoh 1. Kloning ke DNA APT. Sel melanoma manusia Bowes (dibeli dari Dr. Roblin, R. di National Institute for Cancer Research, USA) dikultur menurut metode Opdenakker et al. (Opdenakker, G., dkk., Eur. J. Biochem, 131, 481-487 (1983)). Untuk menginduksi APT mRNA, TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate) ditambahkan ke dalam campuran kultur pada konsentrasi akhir 100 ng/ml, diikuti dengan kultur selama 16 jam. Total RNA seluler kemudian diekstraksi dari sel yang dikultur sesuai dengan metode modifikasi Freeman et al. ((Okeama)Berqa DNA Manual, hal. 3, 1985, Bahan Kimia Farmasi). Menggunakan kolom selulosa oligo-dT (diproduksi oleh Pharmacia Fine Chemicals), poli(A) + RNA dipisahkan dari RNA seluler total. Hasilnya, sekitar 400 μg poli(A) + RNA diperoleh dari sekitar 10 o sel. Poli(A) + RNA ini difraksinasi dengan sentrifugasi gradien kepadatan sukrosa dengan cara konvensional. Sebagian dari poli(A) + RNA yang difraksinasi dipilih dan hibridisasi dot blot dilakukan (Perbal, B., Apractical Gube to Molecular Cloninq, 410, 1984, John Wiley and Sons, Inc) menggunakan probe oligonukleotida khusus untuk APT mRNA . Probe (probe Y) yang digunakan di sini memiliki urutan basa 5"-GCNNGGCAAAAGATGGCA-3", yang melengkapi wilayah mRNA yang mengkode residu asam amino +291 hingga +297 dalam urutan APT yang dijelaskan oleh Pennicaetal, dan disintesis oleh metode -cyanophosphamidate menggunakan penyintesis DNA, model 380A, (diproduksi oleh Applied Biosystems). Sintesis oligomer DNA, deproteksi, pembelahan dan pemurnian resin dilakukan sesuai dengan instruksi manual untuk penyintesis DNA, Model 380A. Menandai isotop radioaktif Probe Y pada ujung 5" dilakukan sesuai dengan manual laboratorium menggunakan polinukleotida kinase T4 (diproduksi oleh Taka-Ra Shuzo Co., Ltd.) dan -(32 P) ATP. Probe Y berhibridisasi secara kuat, terutama dengan 20- 30S poli(A) + RNA (fraksi ini disebut fraksi M). Dengan menggunakan templat, 10 μg poli(A) + RNA diperoleh dari fraksi M; 3 μg cDNA untai ganda disintesis menggunakan transkriptase balik ( diproduksi oleh Biochemical Industry Co., Ltd.) sesuai dengan metode Gubler-Hoffman (Gubler, U. dan Hoffman, B.J., Gene 25, 263, 1983), dan menambahkan untai deoksi C ke cDNA untai ganda di 3" berakhir menurut metode Denq-Wu (Denq, G. R. dan Wu, R., Nucleic Acids Res., 9, 4173, 1981). CDNA beruntai ganda yang diperpanjang dengan rantai deoksi C kemudian dikenai filtrasi gel pada Sepharose CL 4B (diproduksi oleh Fine Chemicals) untuk menghilangkan asam nukleat dengan berat molekul rendah yang memiliki kurang dari 500 pasangan basa. CDNA kemudian dianil dengan pBR322 (diproduksi oleh Bethesda Research) yang mengandung untai deoksi G di situs P st 1 menggunakan metode tradisional . Campuran yang diperoleh setelah anil diubah menjadi sel E. coli HB101 yang kompeten (diproduksi oleh Takara Shuzo Co., Ltd.). Hasilnya adalah bank cDNA yang terdiri dari sekitar 4000 transforman independen. CDNA ini dikenai hibridisasi koloni menggunakan probe Y yang dijelaskan di atas sesuai dengan metode Woods (Woods, D., Focus, 6 (3), 1, 1984, Bethesda Research Lab.), memperoleh klon yang bereaksi dengan probe Y Di antara klon-klon tersebut, klon pTPA1 yang mengandung cDNA APT terpanjang diidentifikasi. Kemudian dilakukan metode dideoksi (Carlson, J., et al., J. Biotechnoloqy, 1, 253, 1984), dengan menggunakan vektor fag M13 dan metode 7-DEAZA (Mizusawa S., et al., Nucleis Acids Res., 14, 1319, 1986). Hasilnya, ditemukan bahwa plasmid pTPA1 mengandung urutan basa dari T y+441 hingga A y+2544 untuk gen APT yang dijelaskan oleh Pennicaetal. Contoh 2. Desain APT (II) yang ditingkatkan. Dalam plasmid pTPA1 yang ditunjukkan pada Contoh 1, wilayah N-terminal tidak cukup untuk membangun APT (II) yang ditingkatkan, yang tidak memiliki domain kringle 1. Oleh karena itu, segmen DNA yang kekurangan disintesis seperti dijelaskan di atas menggunakan penyintesis DNA 380A (diproduksi oleh Applied Biosystems). Urutan basa oligomer yang disintesis dan urutan sintesis lengkap ditunjukkan pada Gambar. 1-4. Teknik khusus untuk membangun APT (II) yang ditingkatkan dengan menggunakan oligomer ini ditunjukkan pada Gambar. 5-6. 2-1). Konstruksi blok IV (fragmen Bql II-Eco R1, sekitar 480 pasangan basa). Fragmen blok IV pada Gambar. 5 diperoleh sebagai berikut. Pertama, menurut petunjuk laboratorium, masing-masing 40 pmol oligonukleotida sintetik 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 dan 15 ditunjukkan pada Gambar. 1-2 difosforilasi dengan 10 unit polinukleotida kinase T4 (diproduksi oleh Takara Shuzo Co., Ltd.) pada suhu 37°C selama satu jam dalam larutan reaksi 50 μl untuk masing-masing unit. Solusi reaksi diolah dengan fenol. Setelah pengendapan dengan etanol, endapan dikeringkan pada tekanan rendah dan dilarutkan dalam air suling steril. Setelah 40 pmol masing-masing oligomer diendapkan dalam 150 μl larutan yang mengandung 6 mM Tris-HCl (pH 7,5), 20 mM NaCl, 7 mM MgCl 2 dan 0,1 mM EDTA, pada suhu 80 o C selama 5 menit, pada suhu 60 o C selama 5 menit dan pada suhu kamar selama satu jam, pada blok yang sesuai yaitu blok I (oligomer 1, 2, 3 dan 4), blok II (oligomer 5, 6, 7, 8, 9 dan 10) dan blok III (oligomer 11, 12, 13, 14, 15 dan 16) melakukan pengendapan dan pengeringan etanol pada tekanan rendah. Residunya dilarutkan dalam 40 μl air suling steril. Reaksi dilakukan dalam 400 μl larutan reaksi pada suhu 4°C selama 15 jam dengan menggunakan alat ligasi DNA (diproduksi oleh Takara Shuzo Co., Ltd.). Setelah pengendapan dengan etanol dan pengeringan pada tekanan rendah, endapan dilarutkan dalam air suling steril: dalam kasus blok I (1), elektroforesis gel dilakukan dalam poliakrilamida 5% (panduan laboratorium), dipisahkan dan dimurnikan dengan cara tradisional (manual laboratorium), fragmen sekitar 100 pasangan basa, dan dalam kasus blok II (2) dan blok III (3), elektroforesis gel dilakukan dalam gel agarosa 3% (Agarosa LMP, diproduksi oleh BRL) (manual lab ) dan fragmen sekitar 190 pasang diisolasi dan dimurnikan dengan elektroelusi (manual lab). Kemudian, masing-masing 0,1 μg, 0,2 μg, dan 0,2 μg fragmen blok I, blok II, dan blok III, diikat menggunakan kit ligasi DNA di atas. Elektroforesis gel dilakukan pada konsentrasi agarosa 1,5% untuk mengisolasi fragmen Bgl II-Eco R1 (blok IV) berukuran sekitar 480 pasangan basa. DNA kemudian diisolasi dari gel agarosa menggunakan elektroelusi. DNA ini kemudian difosforilasi dalam larutan reaksi 100 μl pada suhu 37°C selama satu jam dengan menggunakan 10 unit polinukleotida kinase T4 di atas, kemudian diolah dengan fenol, etanol diendapkan dan dikeringkan pada tekanan rendah. Fragmen gen sintetik dan urutan basa blok IV ini dikonfirmasi dengan menentukan urutan basa menurut metode dideoksi menggunakan vektor fag M13. Teknik khusus ditunjukkan pada Gambar. 6. Setelah mengikat fragmen Bgl II-Eco R1 blok IV yang dijelaskan di atas dengan DNA M13 mp18 (diproduksi oleh Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) dicerna dengan enzim restriksi BamH1 (diproduksi oleh Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd .) dan Eco R1 (diproduksi oleh Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) urutan dasarnya ditentukan menggunakan kit pengurutan M13 (diproduksi oleh Taraka Shuzo K., Ltd.) dan kit pengurutan 7-DEAZA (diproduksi oleh Takara Shuzo Co., Ltd.). Situs pembelahan enzim restriksi Bgl11 dan situs pembelahan enzim restriksi BamH1 diikat dalam susunan isoschimeric melalui (situs pembelahan ujung pembelahan BamH1-Bgl11), dan fragmen yang diikat dapat dibelah oleh enzim restriksi Xho 11, menghasilkan Bgl alami Pembelahan 11 dan Bamh1 masing-masing berakhir. Untuk lebih akurat menentukan urutan basa, E.cjli strain JM109 terinfeksi fag M 13mp18 (termasuk fragmen blok IV) sesuai dengan metode Messing/Messing J., Methods in Enzymology, 101, 20-78 (1983 )), setelah itu diperoleh DNA untai ganda (tipe replikasi). Setelah pencernaan DNA ini (50 μg) dengan enzim restriksi Xho 11 (diproduksi oleh Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co) dan Eco R1, elektroforesis gel dilakukan pada gel agarosa 1,5% untuk mengisolasi fragmen (blok IV) sekitar 480 basa berpasangan. DNA ini diekstraksi dengan elektroelusi. Setelah mengikat DNA yang diekstraksi dengan DNA M13mp19 (diproduksi oleh Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd) yang dicerna dengan enzim restriksi Eco R1 dan BamH1 dengan cara yang sama seperti dijelaskan di atas, urutan basa ditentukan menggunakan kit ligasi DNA. Seperti dijelaskan di atas, urutan ini dapat diverifikasi lebih akurat dengan mengurutkan kedua DNA menggunakan M13mP18 dan M13mp19. Selain itu, DNA replikasi beruntai ganda M13mp19 (dengan blok IV) dibuat dengan metode yang dijelaskan. Setelah pencernaan DNA ini (50 μg) dengan enzim restriksi Eco R1 dan Xho 11, elektroforesis gel dilakukan dalam agarosa 1,5%, mengisolasi sebuah fragmen (blok IV) berukuran sekitar 480 pasangan basa. 2-2). Isolasi blok V (fragmen Eco R1-Bal1, sekitar 1250 pasangan basa). Dari klon pTRA1 yang diperoleh pada Contoh 1, DNA plasmid diisolasi dalam jumlah besar menurut metode yang dijelaskan dalam manual laboratorium, seperti ditunjukkan pada Gambar. 5. Setelah mencerna 70 μg DNA ini dengan enzim restriksi Bal1 (diproduksi oleh Takara Shuzo Co., Ltd.) dan Nar1 (diproduksi oleh Nirro Gen Co., Ltd.), elektroforesis dilakukan dalam gel agarosa 0,8%, mengisolasi fragmen Nar1-Bal1 (sekitar 1540 pasangan basa). DNA diisolasi dengan elektroelusi. Setelah pencernaan parsial lebih lanjut dari DNA ini dengan enzim restriksi Eco R1, elektroforesis dilakukan pada gel agarosa 0,7%, mengisolasi fragmen Eco R1-Bal1 (sekitar 1250 pasangan basa). DNA diisolasi dengan elektroelusi. 2-3). Konstruksi gen APT (II) yang ditingkatkan dari blok IV dan blok V. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 5, gen APT yang ditingkatkan diperoleh sebagai berikut. Setelah doping blok IV (fragmen Bgl11-Eco R1, sekitar 480 bp) diperoleh pada contoh 2-1 dengan blok V (fragmen Eco R1-Bal1, sekitar 1250 bp) diperoleh pada contoh 2-2 menggunakan kit untuk doping DNA yang dijelaskan di atas, produk yang didoping terkena pengendapan etanol. Setelah pengeringan pada tekanan rendah, endapan dicerna dengan enzim restriksi Xho 11 dengan cara konvensional. Elektroforesis kemudian dilakukan dalam gel agarosa 0,8% untuk mengisolasi fragmen Bgl 11-Xho 11 (sekitar 1500 pasangan basa, mengandung gen untuk peningkatan APT). DNA kemudian diisolasi dengan elektroelusi. Urutan basa lengkap dari gen APT (II) yang ditingkatkan yang diperoleh dengan cara ini ditunjukkan pada Gambar. 8-13. Urutan asam amino yang disimpulkan juga ditunjukkan pada Gambar. 14-19. Contoh 3. Konstruksi gen untuk peningkatan APT V, VI dan VIII. Konstruksi perbaikan gen APT V, VI atau VIII dilakukan berdasarkan perbaikan gen APT (II) dengan mengacu pada publikasi berikut. Konversi genetik dilakukan dengan menginduksi mutasi spesifik lokasi. Publikasi: Zoller M.J. dan Smith. M., Method in Fermentology, 100, hlm. 468-500 (1983), Zoller M.J. dan Smith. M. DNA, 3, hal. 479-488 (1984), Morinaga Y. dkk. Bioteknologi, hal. 636-630 (Juli 1984), Adelman J. P. dkk., DNA, 2, hal. 183- 193 (1983 ), 6. M13 Sequencing Manual (puC) diterbitkan oleh Gene Science Room Co., Ltd.). 3-1). Konstruksi gen APT (V) yang ditingkatkan. A) Pembuatan M13mp19 (APT/P/) untuk mutasi. Fragmen gen APT (II) yang ditingkatkan, dijelaskan secara rinci dalam Contoh 2, 2-3), diikat ke DNA untai ganda M13mp9 yang diolah dengan enzim restriksi BamH1 dan alkali fosfatase (diproduksi oleh Takara Shuzo Co., Ltd.). Produk ligasi ditransfusikan ke sel kompeten E. cjli JM109 (diproduksi oleh Takara Shuzo Co., Ltd.). Setiap klon yang menghasilkan bercak steril tidak berwarna digunakan untuk menginfeksi E. Coli JM109. DNA untai tunggal diisolasi dari supernatan kultur, dan DNA untai ganda (replikatif) diisolasi dari sel E. cli sesuai dengan metode Messing (J. Messing, Methods in Enzymology, 101, hlm. 20-78, 1983 ). Dengan menganalisis sifat DNA beruntai ganda ini, setelah pencernaan dengan enzim restriksi Pst1 dengan elektroforesis gel agarosa, diperoleh klon mp9 (peningkatan APT(II)) di mana gen APT(II) dimasukkan ke dalam DNA mp9 di DNA untai ganda. arah yang diinginkan seperti yang ditunjukkan pada Gambar 21. Setelah Pembelahan sebagian DNA ini dengan enzim restriksi Pst dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarosa 0,8%, di mana klon mp9 (APT (II) yang ditingkatkan menunjukkan pita sederhana pada posisi 7300 bp, 840 bp, 430 bp dan 80 bp, kira-kira. DNA untai tunggal dari klon ini digunakan dalam percobaan berikutnya untuk menginduksi mutasi spesifik lokasi. B) Sintesis primer yang mampu menginduksi mutasi spesifik lokasi. Oligonukleotida sintetik yang digunakan untuk menginduksi mutasi spesifik lokasi pada gen APT (II) yang ditingkatkan disintesis dengan metode α-sianoetil fosfoamidat menggunakan penyintesis DNA Model 380 A (diproduksi oleh Applied Biosystems). Sintesis oligomer DNA, penghilangan gugus pelindung, pembelahan dari resin dan pemurnian dilakukan sesuai dengan petunjuk pengoperasian penyintesis DNA 380 A. Untuk menginduksi mutasi pada lokasi tertentu, primer (1) mampu menginduksi mutasi spesifik lokasi dan primer (2) diperoleh untuk pengurutan dideoksi menggunakan vektor fag M13 (J. Carlson et al., Journal of Biotechnology, 1, p. 253, 1984). Urutan asam amino dan nukleotida untuk peningkatan APT (II) diberikan. Primer (1), yang mampu menginduksi mutasi, berbeda pada basis yang digarisbawahi dari urutan gen APT (II) yang ditingkatkan (lihat Tabel 1). C) Induksi mutasi spesifik lokasi. Di bawah ini adalah cara pembuatan klon yang mengandung rangkaian basa primer (1) yang mampu menghasilkan mutasi, yaitu gen APT (IV) yang ditingkatkan. Setelah anil (renaturasi) DNA untai tunggal yang dijelaskan pada contoh 3.3-1), A) klon mp9 (peningkatan APT (II) dan primer (1), produk renaturasi diubah menjadi DNA untai ganda, yang kemudian diubah menjadi E. coli JM109. Kemudian, dengan menggunakan primer pengurutan, sekuens DNA disaring, mengisolasi klon fag yang membawa gen APT (II) yang telah diperbaiki dan bermutasi, yaitu DNA fag beruntai ganda (replikatif) yang telah ditingkatkan diekstraksi dari klon ini dan gen APT (V) yang ditingkatkan diisolasi. fosforilasi terminal 5" dari oligomer sintetik. DNA primer (1) untuk menginduksi mutasi spesifik lokasi difosforilasi dengan metode yang dijelaskan dalam contoh 2.2-1. Persiapan dari heteroduplex DHE. 0,5 μg DNA untai tunggal M13mp9 (peningkatan APT (II). )) dan 1,5 μg DNA untai ganda M13mp9, dicerna dengan enzim restriksi BamH1, dipanaskan dalam larutan 30 μg yang mengandung 2 pmol primer terfosforilasi. (1) 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA dan 50 mM NaCl, pada 90 o C (2 menit), 50 o C (5 menit), 37 o C (5 menit) dan pada suhu kamar ( 10 menit). Tambahkan ke dalam larutan 36 μl larutan Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) yang mengandung 4 unit enzim Klenow, 7 unit DNA ligase fag T4, 0,1 mM EDTA, 12 mM MgCl 2, 10 mM dithiothreitol, 0,7 mM ATP, 0,07 dATP, dan masing-masing 0,2 mM dGTP, dTTP, dan dCTP untuk merangsang pemanjangan primer. Campuran tersebut direaksikan pada suhu 20 o C selama 2 jam dan pada suhu 4 o C selama 15 jam. Transformasi dilakukan dengan menggunakan larutan yang dijelaskan di atas dan sel E. coli JM109 yang kompeten (diproduksi oleh Takara Shuzo Co., Ltd.) hingga terbentuk titik lisis. Setelah bercak tak berwarna dipisahkan, fag diinfeksi E. coli JN109 untuk berkembang biak. Templat DNA untai tunggal kemudian diperoleh dari supernatan kultur untuk setiap klon. DNA beruntai tunggal ini hanya dikenakan reaksi "T" (reaksi "A" dan "T" pada Contoh 3-2) dengan metode dideoksi menggunakan primer pengurutan (2), diikuti dengan elektroforesis gel poliakrilamida. Setelah kering, gel dianalisis dengan autoradiografi. Berdasarkan hasil, teridentifikasi klon yang memiliki urutan mutan yang diinginkan. Supernatan kultur klon digunakan untuk menginfeksi sel E. coli JM109 dan diinokulasi ulang ke dalam pelat untuk mengisolasi satu titik. Dari titik tunggal yang dihasilkan, DNA untai tunggal diisolasi sesuai dengan metode di atas. Dengan menggunakan DNA tersebut, pertama-tama tentukan urutan basa DNA dengan metode dideoksi menggunakan sequencing primer (2), diperoleh klon yang bermutasi ke urutan basa yang diinginkan. Setelah menginfeksi klon fag ini dengan sel JM-109 E. coli menggunakan metode Messing yang dijelaskan dalam Contoh 2, diperoleh DNA untai ganda. DNA untai ganda ini dicerna dengan enzim restriksi Xho 11, elektroforesis dilakukan dalam gel agarosa 0,8% untuk mengisolasi fragmen (gen APT yang ditingkatkan (V) dari sekitar 1500 pasangan basa yang mengandung gen APT yang ditingkatkan. Kemudian DNA diekstraksi dengan elektroelusi. Selain itu, dengan menggunakan metode dideoksi, urutan basa lengkap dari DNA yang diperoleh ditentukan, dimana DNA tersebut ditemukan sebagai gen APT (V) yang ditingkatkan. V) gen (namun mengandung sinyal peptida -35 hingga -1) ditunjukkan pada Gambar 11 - 13. Urutan asam amino yang diturunkan darinya juga ditunjukkan pada Gambar 17 - 19. 3-2) Konstruksi yang ditingkatkan APT (VI) dan (VIII). Tekniknya mirip dengan yang dijelaskan pada contoh 3, 3-1). Pertama, M13mp3 (peningkatan APT (II)) dibuat, dan kemudian primer disintesis untuk menginduksi mutasi spesifik lokasi. Urutan basa dari primer-primer ini dijelaskan di atas, namun, untuk membangun gen APT yang ditingkatkan (VI) dan gen APT yang ditingkatkan (VIII), primer terfosforilasi ujung 5" (3) dan primer terfosforilasi ujung 5" (5) ) digunakan masing-masing (lihat meja 2). Setelah induksi mutasi spesifik lokasi, urutan basa lengkap ditentukan dengan metode dideoksi. Mereka dipastikan memiliki urutan dasar yang diinginkan. Dengan demikian, diperoleh gen untuk peningkatan APT (VI) dan peningkatan APT (VIII). Gen-gen ini kemudian diintegrasikan ke dalam vektor pVY1 sesuai dengan prosedur yang dijelaskan pada contoh 4 dan 5. Contoh 4. Integrasi gen APT (II) yang telah ditingkatkan ke dalam vektor pVY1. 4-1) Konstruksi vektor pVY1. Vektor pVY1 disiapkan seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 7. A) Konstruksi pAdD26SV (A) N3 (N) dan ujung tumpul pada lokasi pembelahan Eco R1. Pertama, DNA pAdD26SV(A) N3 (dibeli dari Dr. Hiroshi Handa di Universitas Tokyo, diketahui dari abstrak di Mo1, Ce 11. Biol, 2 (11, (1982)) dicerna dengan enzim restriksi Bgl11 (diproduksi oleh Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co , Ltd.) dengan cara tradisional. DNA kemudian diakhiri dengan cara konvensional menggunakan enzim Klenow (diproduksi oleh Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) Setelah diolah dengan fenol, pengendapan etanol. , dan dikeringkan di bawah tekanan rendah, endapan dilarutkan dalam air suling steril. ligasi mengubah sel HB101 E. coli yang kompeten (diproduksi oleh Takra Shuzo Co. Ltd.) dengan campuran reaksi. DNA diperoleh dari transforman yang menunjukkan resistensi tetrasiklin dalam dengan cara biasa. Setelah pencernaan sebagian DNA ini dengan enzim restriksi BgL 1, dilakukan elektroforesis pada 0,7% - agarosa. (A) N3 (N)) DNA klon ini dengan enzim restriksi Eco R1 dengan cara tradisional, DNA dibuat tumpul menggunakan enzim Klenow, seperti dijelaskan di atas. Setelah perlakuan dengan fenol, pengendapan dengan etanol dan pengeringan pada tekanan rendah, endapan dilarutkan dalam air suling steril. B) Isolasi fragmen Kpn 1-BamH1 (sekitar 2900 bp) dari pKSV10 dan pembentukan ujung tumpul. Setelah DNA pKSV10 (diproduksi oleh Fine Chemicals) dicerna dengan enzim restriksi Kpn1 dan BamH1 dengan cara tradisional, DNA tersebut dibuat ujungnya tumpul menggunakan DNA polimerase T4 (manual lab, hal. 114 - 121). Elektroforesis kemudian dilakukan dalam gel agarosa 0,7% untuk mengisolasi fragmen berukuran sekitar 2900 pasangan basa. Fragmen tersebut kemudian dielektroelusi untuk mengekstraksi DNA

C) Konstruksi pVY1. Setelah ligasi fragmen DNA yang diperoleh di A) dan fragmen DNA yang diperoleh di B), dilakukan transformasi sel E. coli HB101 yang kompeten (dijelaskan di atas). DNA plasmid diperoleh dari transforman yang menunjukkan resistensi terhadap tetrasiklin menggunakan metode tradisional. Setelah sebagian dari DNA plasmid ini dicerna dengan enzim restriksi Pst1 (diproduksi oleh Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd), elektroforesis dilakukan pada gel agarosa 1,0%. Hasilnya adalah klon (plasmid pVY1) yang dicirikan oleh pita sekitar 3400 pasangan basa, sekitar 3200 pasangan basa, dan sekitar 1400 pasangan basa. Klon E/coli HB101 (pVY1 ini telah disimpan di Lembaga Penelitian Fermentasi Badan Sains dan Teknologi Industri Jepang dengan nomor registrasi P-9625 (FEPM BP 2106). 4-2) Integrasi gen APT yang ditingkatkan (II ) ke dalam vektor pVY1. Setelah DNA plasmid pVY1 yang diperoleh pada Contoh 4-1) dicerna dengan enzim restriksi BgL 11 dengan cara konvensional, defosforilasi dilakukan dengan menggunakan alkali fosfatase (diproduksi oleh Takara Shuzo. Co. Ltd.). Kemudian perlakuan dengan fenol dilakukan sebanyak tiga kali. Dan setelah pengendapan dengan etanol dan pengeringan pada tekanan rendah, endapan dilarutkan dalam air suling steril. Setelah mengikat DNA ini dengan fragmen BgL 11-Xho 11 (sekitar 1500 pasangan basa) yang diperoleh pada Contoh 3, 3-1), dan sel E. coli HB101 yang kompeten ditransformasikan dengan produk ligasi sesuai dengan metode yang dijelaskan di atas. DNA plasmid dibuat dari transforman resisten tetrasiklin dengan cara tradisional. Setelah pencernaan DNA ini dengan enzim restriksi (BqL 11, Pst 1), klon yang memiliki gen APT (II) yang ditingkatkan dalam vektor pVY1 yang terintegrasi ke arah yang diperlukan dipilih, dan seleksi dilakukan berdasarkan analisis pola elektroforesis gel agarosa. Pertama, sebagian dari DNA ini dicerna dengan enzim restriksi BqL 11, diikuti dengan elektroforesis pada gel agarosa 0,8%, diperoleh klon yang memiliki pita fragmen sekitar 1500 bp ketika fragmen BqL 11-Xho 11 diikat ke BqL. fragmen 11 plasmid pVY1, bagian Xho 11 dan BqL 11 yang diikat dapat dipotong dengan enzim restriksi BqL 11. Sebagian DNA plasmid klon ini dicerna lebih lanjut dengan enzim restriksi Pst1, dan DNA tersebut dikenai elektroforesis dalam gel agarosa 0,8% diperoleh klon yang mempunyai ukuran pita tunggal sekitar 3400 bp, dua pita sekitar 2300 bp, satu pita sekitar 1400 bp, dan satu pita sekitar 80 bp. Dengan menggunakan klon ini (plasmid pVY1-APT (II) sesuai dengan petunjuk laboratorium, diperoleh DNA plasmid. Contoh 5. Integrasi gen APT (V), (VI) dan (VIII) yang ditingkatkan ke dalam vektor pVY1. Setelah pembelahan DNA plasmid pVY1 yang diperoleh pada Contoh 4-1), defosforilasi enzim restriksi BqL 11 dilakukan dengan cara konvensional menggunakan alkaline fosfatase (diproduksi oleh Takara Shuzo Co., Ltd.), diikuti dengan perlakuan (3 kali) dengan fenol, pengendapan dengan etanol, dan pengeringan pada tekanan rendah. Endapan tersebut kemudian dilarutkan dalam air suling steril. Setelah mengikat DNA ini dengan fragmen BqLII-Xho 11 berukuran sekitar 1500 pasangan basa yang diperoleh dalam contoh 2, 2-3), produk ligasi diubah menjadi sel E. coli HB101 yang kompeten di atas. DNA plasmid dibuat dari transforman yang menunjukkan resistensi tetrasiklin menurut metode konvensional. Setelah pencernaan DNA ini dengan enzim restriksi BqL11 dan Pstl, dilakukan elektroforesis gel agarosa. Dengan menganalisis pola pemisahan dalam gel agarosa, klon dipilih di mana gen APT (V) yang telah ditingkatkan dimasukkan ke dalam vektor pVYI ke arah yang diinginkan. Pertama, setelah mencerna beberapa DNA ini dengan enzim restriksi BqL11, elektroforesis dilakukan pada gel agarosa 0,8% untuk mendapatkan klon dan diperoleh pita sekitar 1500 pasangan basa. Ketika fragmen BqL11-Xholl dihubungkan dengan fragmen BqL11 dari vektor pVYI, bagian Xholl dan BqL11 dapat dibelah oleh enzim restriksi BqL11 karena konfigurasi isoschizomer yang disebutkan di atas. Setelah pencernaan lebih lanjut sebagian DNA plasma klon ini dengan enzim restriksi Pstl, elektroforesis dilakukan pada konsentrasi gel agarosa 0,8% untuk memperoleh klon yang memberikan pita sekitar 3400 bp, pita sekitar 2300 bp, dua pita sekitar 1400 bp, satu pita sekitar 800 bp dan satu pita sekitar 80 bp. Dengan menggunakan klon (plasmid pVYI-APT (V)), DNA plasmid diperoleh dalam jumlah banyak berdasarkan manual laboratorium. Demikian pula, gen untuk peningkatan APT (VI) dan (VIII) diintegrasikan ke dalam vektor pVYI. Contoh 6 Ekspresi APT Tingkat Lanjut pada Sel CHO. Plasmid pVYI - peningkatan APT (VI), APT (II), APT (V) atau APT (VIII) ditransfusikan ke sel CHO yang kekurangan DHFR (Urlaub, dkk., Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 77 (7 ), 4216-4224, 1980) dengan metode kalsium fosfat (Graham, et al. , Viroloqy, 52, 456, 1973). Klon transforman yang diperoleh pada media selektif (MEM A LPHA (-), GIBCO) dengan adanya metotreksat (MTX) ditemukan menunjukkan aktivitas APT 50 hingga 100 unit/ml (nilai ditentukan dengan metode pelat fibrin/agarosa yang dijelaskan di bawah). Klon ini digunakan untuk penelitian selanjutnya. Media produksi yang digunakan adalah media GIT (diproduksi oleh Huaco Pure Chemical Industry Co., Ltd.) yang ditambah dengan 20 international unit/ml (SIGMA) aprotinin. Contoh 7. Pemurnian APT yang ditingkatkan dari supernatan kultur sel CHO. Supernatan kultur yang diperoleh dalam Contoh 6 dimurnikan sebagian pada kolom afinitas antibodi monoklonal anti-APT. Antibodi monoklonal penghasil hibrida disiapkan untuk APT yang berasal dari sel melanoma manusia dengan cara tradisional. Hibrida penghasil antibodi diinokulasi ke tikus, dan antibodi monoklonal (subkelas: IgGM1) yang dikembangkan di asites diekstraksi dan dimurnikan menggunakan Cellulophin Protein A (diproduksi oleh Biochemical Industry Co., Ltd.) dan sistem buffer pemurnian antibodi monoklonal MAPS yang diproduksi. oleh Laboratorium Biorad. Antibodi tersebut digabungkan dengan Sepharose yang diaktifkan CN3r (diproduksi oleh Pharmacia Fine Chemicals) dengan kecepatan 4 mg per 1 ml gel dengan cara tradisional. Gel antibodi (24 ml) dicampur dengan empat liter supernatan kultur. Setelah dikocok perlahan semalaman pada suhu 4°C, gel dimasukkan ke dalam kolom (diameter 1,5 cm x 20 cm). Gel kemudian dicuci berturut-turut dengan masing-masing 125 ml solusi berikut (1) Buffer Tris-HCl pH 7,4 (buffer A) mengandung 25 international unit/ml aprotinin (diproduksi oleh SIGMA) dan 0,01% (b/v) Tween 80, (2) buffer A mengandung 0,5 M NaCl, (3) buffer A mengandung 4 M urea, dan (4) buffer A. APT berikatan gel yang ditingkatkan dielusi dengan 0,2 M glisin-HCl pH 2,5 buffer yang mengandung 25 unit internasional/ml aprotinin dan 0,01% (b/v) Tween 80. Fraksi aktif dikurangi dan digabungkan. Setelah dialisis terhadap 10 mM buffer Tris-HCl, pH 7,4, mengandung 25 unit internasional/ml aprotinin dan 0,01% (b/v) Tween 80 semalam, dialisat dipekatkan 20-30 kali dengan konsentrat sentrifugal vakum (Speed ​​VAC, diproduksi oleh SAVANT Inc.). Konsentrat didialisis lagi dengan 10 mM buffer Tris-HCl, pH 7,4, mengandung 0,15 M NaCl, 25 unit internasional/ml aprotinin dan 0,01% (berat/vol) Tween 80, semalaman, dan digunakan untuk penilaian in vitro dan in vivo selanjutnya. . Akhirnya, aktivitas spesifik meningkat 3700-5000 kali lipat, dan hasil dari 36 hingga 42% aktivitas APT (ditentukan dengan metode pelat fibrin/agarosa). Fraksi aktif ini dianalisis dengan elektroforesis natrium dodesil sulfat dan pewarnaan perak. Dalam kondisi tereduksi, pita yang sangat kuat terlihat pada 54 kilodalton, bersama dengan beberapa pita lainnya. Gel elektroforesis kemudian diolah dengan 2,5% (b/v) Triton X-100 dan ditempatkan pada pelat fibrin/agarosa untuk menandai fibrin pada suhu 37°C, dimana pita terlarut terdeteksi pada sekitar 50 kilodalton. Di piring yang sama, APT alami muncul sekitar 60 kilodalton. Hasilnya menunjukkan bahwa APT yang teradsorpsi ke kolom afinitas antibodi dan dielusi dengan metode ini sesuai dengan APT yang ditingkatkan yang memiliki berat molekul sekitar 10.000 lebih kecil dari berat molekul jenis alami. Contoh 8. Pengukuran aktivitas spesifik peningkatan APT. Jumlah protein dalam APT lanjutan yang dimurnikan sebagian ditentukan dengan mengukur total protein menurut metode BradFord (Bradford, Anal. Bochem., 72, 248 (1976)), menggunakan albumin serum sapi sebagai protein referensi. Jumlah antigen APT diukur dengan enzim-linked immunosorbent assay (ELISA). Aktivitas fibrinolitik ditentukan dengan metode pelat fibrin/agarosa dan metode pembubaran film fibrin berlabel 125 1. Pelat fibrin/agarosa dibuat dengan menambahkan agar ke dalam 95% fibrinogen yang terkoagulasi. Metode untuk melarutkan film fibrin 125 berlabel 1 dilakukan seperti yang dijelaskan oleh Hoyraeerts dkk. (J. Biol. Chem. 257, 2912, 1982), menggunakan APT standar dari sel melanoma manusia yang diproduksi oleh Bioscott Inc. dan distandarisasi sesuai dengan Standar Internasional APT (Gaffuey dan Curtis, Thromb. Haemostas, 53, 34, 1985). Nilai aktivitas spesifik dihitung dari nilai aktivitas yang ditentukan dengan metode disolusi film 125 1-fibrin dan jumlah antigen yang ditentukan dengan enzim-linked immunosorbent assay (ELISA), berkisar antara 300.000 hingga 420.000 unit/mg antigen. Contoh 9. Afinitas peningkatan APT untuk fibrin dan aktivasi oleh fibrin

Sesuai dengan karya Verheijen, et al./EMBOJ, 5, 3525, 1986) afinitas APT yang ditingkatkan untuk fibrin dipelajari. APT yang ditingkatkan atau terjadi secara alami (1000 unit/ml) ditambahkan ke fibrinogen pada berbagai konsentrasi, diikuti dengan penambahan satu unit trombone, diikuti dengan reaksi pada suhu kamar selama 3 menit. Bekuan fibrin yang dihasilkan diendapkan dengan cara sentrifugasi pada kecepatan 16.000 rpm selama 8 menit dan jumlah APT yang tidak terikat pada fibrin ditentukan dengan mengukur aktivitas metode fibrin/agarose plate. Hasilnya, ditemukan bahwa APT (VI) yang ditingkatkan menunjukkan afinitas yang sama terhadap fibrin seperti bentuk alaminya. Untuk menyelidiki tingkat aktivasi plasminogen oleh APT yang ditingkatkan dengan ada atau tidaknya fibrin, percobaan berikut dilakukan. Dengan menggunakan pelat titrasi, APT alami atau yang ditingkatkan ditambahkan ke buffer Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, mengandung 0,3 mM substrat sintetik p-niroanilide tripeptida S-2251 (H-D-Val-leulys-pNA. HCl, diproduksi oleh Kabi Inc. .), 0,13 µM plasminogen tanpa plasmin, 120 µg/ml DESAFIB TM (diproduksi oleh American Diagnostics Inc.) dan 0,1% Tween 80, menghasilkan volume total 200 µl. Sistem dipertahankan pada suhu 37°C. Setelah jangka waktu tertentu, absorbansi (densitas optik) diukur pada panjang gelombang 405 nm menggunakan Model Titertech Multiscan 310. Kurva dosis-respons untuk aktivitas midolitik dari APT (VI) yang ditingkatkan dan APT yang terjadi secara alami ditunjukkan pada Gambar. 22. Pergeseran kurva respon dosis akibat penambahan DESAFIB TM untuk APT alami bernilai 158 kali, sedangkan untuk APT yang ditingkatkan mencapai 100 kali. Hal ini disebabkan aktivitas APT(VI) yang ditingkatkan tanpa adanya obat DESAFIB TM lebih rendah, sekitar 1/20, dibandingkan aktivitas APT alami. Contoh 10. Analisis peningkatan APT untuk aktivitas fibrinolitik dalam aliran darah kelinci. Farmakinetik dengan membandingkan aktivitas APT yang terjadi secara alami (n-APT) dan APT yang ditingkatkan dari penemuan ini pada kelinci. Seperti yang dapat dilihat dari Gambar. 23, APT yang ditingkatkan menunjukkan perpanjangan waktu paruh biologis yang nyata dalam keadaan aktif (APT alami menunjukkan waktu paruh 1-2 menit, sedangkan APT yang ditingkatkan aktif secara biologis selama 8-15 menit). Selain itu, terbukti bahwa nilai aktivitas 5% (nilai pada 30 detik setelah pemberian adalah 100%) masih tetap pada APT yang ditingkatkan bahkan 60 menit setelah pemberiannya (APT alami menunjukkan aktivitas sebesar 0,1 setelah 60 menit) .% dari yang awal). Eksperimen ini dilakukan sebagai berikut

Kelinci putih Jepang dengan berat 2,4 kg dipilih untuk pengujian. Di bawah anestesi pentobarbital, APT diberikan melalui vena telinga perifer. Dosisnya adalah 15.400 unit (0,8 ml) APT yang ditingkatkan per kelinci dan 5.400 unit (0,8 ml) n-APT per kelinci (nilai ditentukan dengan metode pelat fibrin). Kemudian, 2,5 ml darah diambil dari arteri femoralis menggunakan kateter pada berbagai interval waktu (0,5 hingga 60 menit) dan ditambahkan ke 1/9 volume natrium sitrat (3,8%). Dalam waktu 30 menit setelah pengambilan darah, sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan rendah, memisahkan plasma. Menggunakan plasma yang dipisahkan, aktivitas APT dalam darah diukur. (1) Pengukuran aktivitas APT. Setelah mengencerkan 0,2 ml plasma dengan asam asetat glasial 3 mM sebanyak 16 kali, produk encer disentrifugasi dengan kecepatan putaran rendah untuk memperoleh endapan. Endapan dilarutkan dalam 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, dengan 140 mM NaCl dalam volume yang setara dengan volume plasma untuk memperoleh fraksi euglobulin. Aktivitas APT ditentukan dengan menambahkan fraksi euglobulin ini ke dalam cawan fibrin/agarosa. Setelah plat diinkubasi pada suhu 37°C selama 16 jam, aktivitas APT diamati sebagai plak. Kurva standar untuk fibrin/agarosa metode cangkir diperoleh dengan mengencerkan APT yang digunakan untuk pemberian pada hewan menjadi 0,1-10,000 unit/ml. Aktivitas APT darah yang ditentukan dengan cara ini dinyatakan dalam persentase, menggunakan aktivitas APT yang diperoleh dengan mengambil darah 30 detik setelah pemberian, diambil 100%. Contoh 11. Peningkatan stabilitas APT(VI) terhadap panas dan asam. Untuk menentukan ketahanan panas, APT (VI) yang ditingkatkan dan APT alami diencerkan dengan 50 mM buffer Tris yang mengandung 100 mM NaCl dan 0,01% Tween 80, pH 7,4, masing-masing hingga konsentrasi 100 μg/ml. Masing-masing larutan disimpan dalam air mendidih (suhu 98 o C) selama 2-60 menit. Setelah pendinginan, aktivitas sisa ditentukan dengan metode pelat fibrin. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 24, penurunan aktivitas APT (VI) yang ditingkatkan tidak signifikan dibandingkan dengan penurunan aktivitas APT alami. Misalnya setelah perlakuan panas selama 2 menit, aktivitas APT alami berkurang menjadi 25%, sedangkan APT(VI) yang ditingkatkan masih mempertahankan aktivitas pada 71%. Untuk mempelajari ketahanan asam, APT(VI) yang ditingkatkan dan APT alami dilarutkan dalam 0,5N. Larutan HCl pada konsentrasi 100 μg/ml, dilanjutkan dengan pengendapan pada suhu kamar selama 30 menit. Setelah netralisasi, aktivitas ditentukan dengan menggunakan metode pelat fibrin. APT yang ditingkatkan tidak menunjukkan adanya perubahan aktivitas, sedangkan aktivitas APT alami berkurang sebesar 50%. Contoh 12 Penghambatan faktor perangsang limfosit aktif dengan meningkatkan APT (VI)

Peningkatan APT (VI) dan APT alami diencerkan secara tepat dalam media kultur jaringan PPM1 1640 yang mengandung 7% serum janin anak sapi dan 58 μM 2-mercaptoetanol. 100 μl pengenceran dimasukkan ke dalam pelat kultur jaringan 96 sumur, setelah itu 50 μl suspensi sel yang mengandung timosit (210 7 sel/ml) dari tikus C3H/He J jantan berusia 4 hingga 6 minggu, concanavalin A (1.2 μg/ml), serta 50 μl IL-1 (4 unit/ml, Aenzyme Inc), dilanjutkan dengan budidaya selama 48 jam dalam inkubator pada suhu 37 o C yang mengandung 5% karbon dioksida. Kemudian ditambahkan H3-timidin dengan konsentrasi 0,5 μ. kubus inci /20 μl/sumur. Setelah dikultur selama 18 jam, sel dikumpulkan pada filter serat kaca dan jumlah 3 H-timidin yang dimasukkan ke dalam sel diukur dengan penghitung kilau cair untuk menentukan aktivitas faktor perangsang limfosit. Seperti ditunjukkan pada Gambar 25, APT alami tidak menghambat aktivitas faktor perangsang limfosit, namun APT yang ditingkatkan secara signifikan menekannya. Ketika diuji dengan pelarut saja, tidak ada efek yang diamati. Contoh 13 Aktivitas antiinflamasi berdasarkan protein terdenaturasi. 1) Memperoleh protein terdenaturasi. Setelah menginkubasi larutan protein (5 mg/ml) dalam 0,1 N. Larutan HCl atau 0,1 N. Larutan NaOH pada suhu 37 o C selama 2-3 jam, larutan protein dinetralkan dengan NaOH atau HCl dalam jumlah yang sama. 2) Afinitas peningkatan APT (VI) terhadap protein terdenaturasi. Metode: Menurut prosedur yang diberikan di bawah ini, protein yang terdenaturasi “dilekatkan” pada lapisan nitroselulosa. Jumlah APT yang ditingkatkan yang terkait dengan perlakuan protein dan lapisan nitroselulosa kemudian diukur, sehingga menilai afinitas APT yang ditingkatkan terhadap protein yang didenaturasi. Sepotong film nitroselulosa direndam dalam larutan buffer Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, mengandung 140 mM NaCl. Pengeringan. Protein terdenaturasi (50 μg/10 μl) dilepaskan setetes demi setetes ke selembar film nitroselulosa. Pengeringan. Pemblokiran dengan larutan gelatin 3%. Pembilasan. Sepotong film nitroselulosa direndam dalam larutan APT yang ditingkatkan /1 μg/ml/. Pembilasan. Ditambahkan plasminogen dan substrat sintetik S-2251, setelah itu dilakukan inkubasi pada suhu 37 o C ( Analisis kuantitatif untuk menyerap APT tingkat lanjut). Pengukuran serapan pada 405 nm. Hasil: Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3, peningkatan APT menunjukkan afinitas terhadap imunoglobulin G yang diberi perlakuan HCl, albumin yang diberi perlakuan HCl, dan albumin yang diberi perlakuan NaOH. Di sisi lain, peningkatan APT tidak menunjukkan afinitas terhadap imunoglobulin G dan albumin yang utuh. 3) Aktivasi peningkatan APT (VI) oleh protein terdenaturasi. Metode: plasminogen (0,0078 unit dalam 10 μl), 100 μl substrat sintetik 3 mM S-2251 dan berbagai jumlah buffer TBS ditambahkan ke larutan reaksi aktivator APT yang ditingkatkan (protein terdenaturasi, BrCN - fibrinogen yang diproses, dll.) pada berbagai konsentrasi, diperoleh 0,275 ml larutan reaksi. APT tingkat lanjut (2,5 n/g dalam 25 μl) ditambahkan ke larutan reaksi untuk memulai reaksi. Setelah bereaksi selama jangka waktu tertentu, 2% natrium dodesil sulfat (jumlah ekuimolar) ditambahkan ke dalam larutan reaksi untuk menghentikan reaksi. Dengan mengukur kepadatan optik (OD 405), aktivitas APT yang ditingkatkan ditentukan. Hasil: Seperti ditunjukkan pada Gambar 26, albumin yang diberi NaOH dan imunoglobulin G yang diberi HCl menunjukkan efek pengaktifan yang kuat dari peningkatan APT. Khususnya, pada imunoglobulin G yang diberi HCl, aktivasinya kuat, dan aktivitas imunoglobulin G yang diberi HCl kira-kira sama dengan aktivitas fibrinogen yang diobati dengan BrCN, dan pada konsentrasi yang beberapa kali lebih rendah. Albumin utuh dan imunoglobulin G tidak menunjukkan aktivasi. 4) Degradasi protein terdenaturasi di bawah pengaruh peningkatan APT (VI). Metode: Setelah mereaksikan protein terdenaturasi dengan APT yang ditingkatkan dalam kondisi yang sama seperti pada metode yang dijelaskan pada subparagraf sebelumnya, kecuali substrat sintetik S - 2251 tidak ditambahkan ke sistem reaksi dan jumlah protein terdenaturasi adalah 133 μg/ ml, elektroforesis dilakukan dalam gel poliakrilamida dengan natrium dodesil sulfat dengan adanya -merkaptoetanol. Hasil: Seperti ditunjukkan pada Gambar 27, protein yang didenaturasi dengan perlakuan NaOH atau perlakuan HCL mengakibatkan hilangnya pita protein-ef dari pola dan pembentukan produk degradasi, yang menunjukkan penguraiannya. Di sisi lain, ketika menggunakan albumin utuh, tidak ada perubahan pola ef yang terdeteksi setelah interaksi dengan APT yang ditingkatkan, dan oleh karena itu, tidak ada degradasi protein yang terdenaturasi yang terdeteksi.

MENGEKLAIM

1. Aktivator plasminogen jaringan rekombinan yang mempunyai urutan asam amino seperti yang diberikan pada hal. dimana Y adalah Glu-Ile-Lys;

H 2 N - ujung amino;

COOH - ujung karboksi;

R - tautan langsung atau urutan serupa yang mengandung substitusi dan/atau penghapusan dan/atau penyisipan yang tidak terkait dengan perubahan aktivitas,

Dan mempunyai sifat sebagai berikut: aktivitas fibrinolitik, ditentukan dengan metode pelarutan film I-fibrin 1 2 5, kemampuan untuk diaktifkan oleh fibrin dan aktivitas peningkatan tpA tanpa adanya fibrin, yang lebih rendah dari aktivitas fibrin. tpA alami, peningkatan waktu paruh dibandingkan bentuk alami, peningkatan dibandingkan tpA alami, ketahanan terhadap asam dan panas, kemampuan menghambat faktor pengaktif limfosit, dan kemampuan untuk diaktifkan oleh protein yang terdenaturasi. 2. Suatu metode untuk memproduksi aktivator plasminogen jaringan rekombinan, termasuk budidaya sel inang yang ditransformasikan dengan DNA rekombinan yang mengandung urutan yang mengkode analog tpA, dan pemurnian selanjutnya dari produk target, ditandai dengan sel inang yang dibudidayakan ditransformasikan dengan vektor rekombinan yang mengandung a Urutan DNA yang mengkode tpA dengan klausa 1.

Aktivator plasminogen (PA) adalah protease serin yang sangat spesifik dari tipe pengatur. Ada banyak AP yang diketahui diisolasi dari darah dan cairan biologis lainnya serta jaringan manusia. Mereka dibagi menjadi aktivator fisiologis, yang tergantung pada sumber produksinya, dapat berupa jaringan (organ), pembuluh darah (aktivator plasminogen jaringan), plasma, darah, urin (urokinase), dll. dan diisolasi dari mikroorganisme (streptokinase). Hampir semua AP dibentuk dalam bentuk proenzim (proaktivator plasminogen).

Aktivasi plasminogen dapat berupa:

eksternal - di bawah pengaruh aktivator jaringan, darah, dinding pembuluh darah, yang dilepaskan ke dalam darah di bawah pengaruh berbagai faktor;

internal - dengan partisipasi protein plasma - faktor Hageman, prekallikrein, kininogen dengan berat molekul tinggi;

eksogen - setelah masuknya aktivator plasminogen ke dalam tubuh (streptokinase dan obat-obatan yang dibuat berdasarkan itu, urokinase, kompleks streptokinase-lys-plasminogen; aktivator plasminogen jaringan yang diperoleh melalui rekayasa genetika, dan obat lain) untuk tujuan terapeutik.

Jalur intrinsik aktivasi fibrinolisis(Fibrinolisis tergantung Hageman) diprakarsai oleh faktor Hageman (faktor CP) plasma darah. Setelah fiksasi faktor XII dan kompleks kininogen-prekallikrein dengan berat molekul tinggi pada permukaan asing atau yang diubah (kolagen atau lainnya), kalikrein aktif dibentuk melalui proteolisis terbatas, yang mengkatalisis konversi faktor XII menjadi bentuk aktifnya, faktor XIIa. . Yang terakhir mendorong konversi plasminogen menjadi plasmin. Kalikrein bebas juga merupakan aktivator plasminogen langsung.

Fibrinolisis yang bergantung pada Hageman diaktifkan bersamaan dengan aktivasi serangkaian reaksi pembentukan protrombinase melalui mekanisme internal dan tujuan utamanya adalah untuk membersihkan dasar pembuluh darah dari bekuan fibrin yang terbentuk selama proses koagulasi intravaskular. APG yang terkandung dalam sel darah dapat berpartisipasi dalam aktivasi fibrinolisis yang bergantung pada Hageman.

Jalur aktivasi plasminogen ekstrinsik– jalur utama kerusakan jaringan, distimulasi oleh berbagai aktivator plasminogen jaringan. Yang paling penting di antaranya adalah aktivator plasminogen jaringan (tPA) , yang disintesis oleh sel endotel pembuluh darah dan, jika diperlukan, digunakan untuk mengaktifkan fibrinolisis (Gbr. 13.15).

Gambar 13.15. Skema struktur tPA

dermaganya. massa 70 kDa, memiliki satu domain, strukturnya mirip dengan EGF, 2 kringle dan domain mirip jari, yang menyerupai struktur plasmin. Sekresi tPA oleh sel endotel terjadi tidak hanya selama trombosis vaskular, tetapi juga selama kompresi manset, selama aktivitas fisik, di bawah pengaruh zat vasoaktif (adrenalin, norepinefrin) dan obat-obatan tertentu. Aktivator ini dan penghambatnya memberikan pengaturan aktivitas fibrinolitik yang konstan. tPA menyumbang 85% aktivitas fibrinolitik eksternal darah.

Dari segi struktur dan mekanisme kerjanya, tPA mirip dengan aktivator fibrinolisis lain yang terdapat di jaringan berbeda, yang masuk ke dalam darah jika terjadi kerusakan jaringan (trauma, kerusakan jaringan, patologi kebidanan, dll). Tempat khusus di antara faktor fibrinolisis jaringan (organ) ditempati oleh faktor yang diproduksi oleh jaringan ginjal dan epitel saluran kemih. urokinase, sebagian besar diekskresikan melalui urin. Urokinase menyediakan sekitar 10-15% aktivitas fibrinolitik eksternal darah. Ia mampu menembus ke dalam bekuan darah dan mengkatalisis konversi plasminogen menjadi plasmin, sehingga menghancurkan bekuan darah tidak hanya dari luar, tetapi juga dari dalam.

Aktivator plasminogen darah terkandung dalam sel darah (eritrosit, trombosit dan leukosit) dan dilepaskan selama aktivasi dan penghancurannya, serta selama pembentukan trombus, terutama yang disebabkan oleh endotoksin.

Dari aktivator eksogen, yang paling banyak dipelajari streptokinase – protein non-enzimatik (massa mol 47 kDa), diproduksi oleh streptokokus β-hemolitik dan dalam kondisi normal tidak ada dalam darah. Streptokinase, seperti decase, celease, avelysin dan lain-lain, tidak memiliki aktivitas enzimatik independen terhadap plasmin, tetapi ketika bergabung dengan plasminogen, mereka membentuk kompleks yang memulai konversi plasminogen menjadi plasmin. Dengan demikian, streptokinase mengaktifkan plasminogen yang terikat pada bekuan fibrin, serta plasminogen dalam fase larut, yang disertai dengan pembentukan plasmin bebas. Dengan infeksi streptokokus, pembentukan streptokinase dalam jumlah besar dimungkinkan, yang dapat menyebabkan peningkatan fibrinolisis (fibrinogenolisis) dan perkembangan diatesis hemoragik. Konversi plasminogen menjadi plasmin, serta proses lisis bekuan fibrin itu sendiri, terjadi pada permukaan bekuan tersebut. Gumpalan fibrin secara selektif menyerap dan menahan plasminogen. Daerah kaya lisin (LN), yang terletak di bagian tengah molekul fibrin(ogen), berikatan dengan domain kringle plasminogen, sedangkan satu molekul plasminogen berikatan dengan beberapa molekul fibrin(ogen), yang memungkinkan molekul plasmin bekerja. molekul fibrin utuh baru, tetap terikat dengan substrat dan menghindari masuk ke dalam larutan dan inaktivasi setelah kontak dengan a2-antiplasmin. Bersama dengan plasminogen, bekuan fibrin secara spesifik mengikat aktivator plasminogen. Aktivator plasminogen jaringan memiliki aktivitas katalitik yang rendah tanpa adanya fibrin dan diaktifkan ketika berikatan dengannya. Aktivator tipe jaringan, dengan pengecualian urokinase, memiliki afinitas yang lebih tinggi terhadap fibrin dibandingkan dengan fibrinogen, yang menjelaskan fibrinolisis yang dominan dan tingkat fibrinogenolisis yang sangat lemah. Kehadiran plasminogen dan aktivatornya secara simultan pada permukaan fibrin memastikan pembentukan plasmin secara alami, dan fibrin dipecah menjadi fragmen larut yang disebut produk degradasi fibrin(PDF).

Berbagai PDF menunjukkan sifat antikoagulan, antipolimerisasi, antiagregasi, dan lainnya. Penentuan PDF awal dan akhir dilakukan untuk diagnosis dini perubahan aktivitas fibrinolitik, tahapan sindrom DIC, diferensiasi fibrinolisis primer dan sekunder. Baik aktivator plasmin maupun plasminogen tidak berikatan dengan PDP dan, ketika bekuan larut, mereka memasuki plasma, di mana mereka diinaktivasi oleh inhibitor alami.

Dan merupakan komponen penting dari sistem fibrinolisis. Aktivator plasminogen merupakan salah satu enzim yang paling sering terlibat dalam proses penghancuran membran basal, matriks ekstraseluler dan invasi sel. Ini diproduksi oleh endotelium dan terlokalisasi di dinding pembuluh darah [Loscalso, ea 1988]. Faktor jaringan adalah fosfolipoprotein. Apoprotein kompleks ini merupakan glikoprotein membran integral dengan molekul. beratnya sekitar 46 kDa, yang terikat erat dengan fosfolipid pada membran endotel, sel otot polos, dan monosit. TPA disintesis in vivo sebagai polipeptida rantai tunggal (berat molekul 72 kDa), yang diubah menjadi bentuk rantai ganda melalui proteolisis oleh berbagai proteinase, termasuk plasmin, kalikrein jaringan, dan faktor X yang diaktifkan. Bentuk tPA rantai ganda lebih aktif dibandingkan prekursor rantai tunggal. PH optimum kerja enzim dalam mengubah angiotensinogen menjadi Ang II berada pada daerah asam. Lihat tPA sebagai enzim pembentuk ang II. TPA, diukur dalam darah, adalah aktivator endotel yang dilepaskan ke aliran darah di bawah pengaruh berbagai rangsangan. Konsentrasi tPA dalam darah adalah 6,6+/-2,9 ng/ml.

Faktor jaringan, suatu glikoprotein transmembran, adalah anggota keluarga reseptor sitokin kelas II dan dapat menyebabkan aktivasi sel melalui dua mekanisme.

Faktor jaringan, penggagas aktivasi mekanisme pembekuan darah ekstrinsik, terlokalisasi di sel endotel dan otot polos, bila rusak, bersentuhan dengan darah, yang pada akhirnya berkontribusi pada pembentukan trombin dan permulaan mekanisme pembekuan darah. Ia memiliki afinitas tinggi terhadap f.VII yang bersirkulasi dalam darah. Dengan adanya ion Ca++, apoprotein T.f. membentuk kompleks stoikiometri dengan f.VII, menyebabkan perubahan konformasi dan mengubah f.VIIa menjadi serin proteinase f.VIIa melalui pemutusan ikatan peptida Arg-152-Ile. Reaksi ini dirangsang oleh sejumlah kecil proteinase yang bersirkulasi dalam darah (f.Xa, trombin, f.VIIa, f.IXa). Kompleks yang dihasilkan (f.VIIa-T.f.) mengubah f.X menjadi serin proteinase f.Xa. Kompleks faktor jaringan-faktor VII mampu mengaktifkan faktor X dan faktor IX, yang pada akhirnya mendorong pembentukan trombin a [Boyle, E.M., Verrier, E.D.,ea., (1996)].

Dalam struktur protein T.f. ada tiga domain yang dibedakan: domain utama, terletak di permukaan membran sel, transmembran dan sitoplasma. Domain permukaan yang mengandung 219 residu asam amino Ser-1-Glu-219 memiliki fungsi reseptor. Domain transmembran beranggotakan 23 orang diikuti oleh “ekor” sitoplasma, yang dengannya protein diamankan ke membran. Di sini, kemampuan residu Cys tunggal dari domain ini untuk membentuk ikatan tioester dengan lipid membran (palmitat atau stearat) diwujudkan. Peran tertentu diberikan pada residu asam amino alifatik, dengan bantuan protein yang diintegrasikan ke dalam lapisan dalam membran, sehingga meningkatkan “penahan” molekul faktor jaringan. Domain permukaan terglikosilasi pada tiga residu treonin (Thr-13, Thr-126, Thr-139). Ini mengandungi 4 residu Cys yang membentuk dua ikatan disulfida, satu di terminal-N dan yang lainnya di wilayah terminal-C domain. Ikatan ini menstabilkan loop peptida yang sesuai. Telah terbukti bahwa ikatan disulfida yang terletak di wilayah terminal C secara fungsional signifikan; partisipasinya diperlukan untuk manifestasi fungsi kofaktor faktor jaringan dalam kaitannya dengan faktor VII dan VIIa. Berdasarkan analisis struktur primer, lokasi ikatan disulfida dan studi fitur fungsional, homologinya dengan interferon Ifn-alphaR dan Ifn-gammaR dari keluarga reseptor sitokin kelas II terungkap. Dalam sistem pembekuan darah, interaksi faktor VII/VIIa dengan reseptor - kofaktor - faktor jaringan, mempercepat aktivasi mekanisme hemokoagulasi eksternal beberapa ribu kali lipat. Percepatan ini dicapai:

Pertama, melalui mekanisme proteolitik, diawali dengan terbentuknya kompleks faktor jaringan dengan faktor VII/VIIa (VII aktif) pembekuan darah, dimana faktor jaringan bekerja sebagai kofaktor dan modulator faktor VII/VIIa. Pengikatan faktor VIIa ke faktor jaringan menyebabkan peningkatan fosforilasi Ca2+ intraseluler dari protein kinase teraktivasi mitogen (MAP kinases) - Erk-1, Erk-2, p38, Jnk dan menyebabkan transkripsi gen Egr-1 (pertumbuhan awal respon), biasanya disebabkan oleh sitokin dan faktor pertumbuhan.

Kedua, melalui mekanisme non-proteolitik, di mana domain sitoplasma faktor jaringan itu sendiri terlibat dalam sinyal intraseluler, yang menyebabkan